Implementation of controlled reproduction techniques on marine invertebrates: gastropod molluscs of Patella genus Sperimentazione di tecniche di riproduzione controllata di invertebrati marini: Molluschi gasteropodi, Genere Patella

The PhD project was mainly focused on the implementation of controlled reproduction techniques in the Patella genus. The species considered were P. caerulea and more particularly P. ferruginea, a protected and endangered species, whose repopulation is the subject of the European ReLife project (LIFE15 NAT/IT/000771). Being P. ferruginea a protected species, we initially preferred to test the non-lethal induction treatments on a cogeneric species, P. caerulea, common and abundant along the Italian coasts. The various treatments tested have provided excellent results, and the “bubbling” treatment was the best, both in terms of time of response to stimulation of the specimens and of replicability and ease of use. The results obtained made it possible to draw up a non-lethal spawning protocol, and to carry out artificial fertilization with subsequent larval development and settlement of the juveniles (Ferranti et al., 2018). In addition, monitoring was carried out along the Ligurian coast, which allowed reporting the presence of P. ferruginea, considered extinct along these coasts (Espinosa et al., 2014). P. ferruginea distribution, along the Ligurian coasts, is extremely scarce and fragmented; in fact the species has been found as isolated specimens or small groups, such as in the Cinque Terre MPA. However, these findings permitted to expand the mapping of the presence of P. ferruginea along the Mediterranean coasts (Ferranti et al., 2019). Furthermore, to better understand the reproductive cycle and the timing of P. ferruginea natural spawning at our latitudes, we placed specimens at sea for maturation in natural conditions, up to the beginning of the expected reproductive period. Specimens were later subjected to a biopsy of the gonad, both before being placed in the sea to determine sex (Guallart et al., 2013a), and at the beginning of the expected reproductive period to understand the stage of maturation. The observation of the material obtained through biopsy made it possible to determine that the specimens had reached gonadal maturation and that one of them had performed sex change, an event known in the literature, but observed here for the first time at the north-western Mediterranean latitude (Ferranti et al., 2021). This implies that the species can complete its reproductive cycle along the Ligurian coasts. Always in view of a better understanding of the timing of gonad maturation, we applied the Magnetic Resonance Imaging (MRI) techniques on limpets. MRI, through a non-invasive approach, allowed to observe the thickness of the gonad and also to understand whether or not a specimen had released gametes, in order to eventually apply stimulation techniques to spawning only at the right time, reducing stress on specimens. The results indicated that MRI can be very useful as an additional tool, both in evaluating the sexual maturity of P. ferruginea and in minimizing the number of induction trials for each specimen, and consequently the stress (Guallart et al., 2020). Even more relevant is having provided evidence, for the first time, that spawning can be induced in P. ferruginea and demonstrated the feasibility of obtaining juveniles, under controlled conditions through low-invasive methods. These results allowed drawing up a preliminary protocol on the induction of spawning of P. ferruginea, which allows for the spontaneous release of gametes, without sacrificing the broodstock of a protected species. Furthermore, this allowed us to carry out an artificial fertilization that led to larval development, settlement, metamorphosis and growth of a pretty large number of P. ferruginea juveniles (Ferranti et al., in prep.). Consequently, knowing that the species is present along the Ligurian coast, that it manages to reach maturity even at these latitudes, and that it is possible to reproduce P. ferruginea under controlled conditions until it reaches the juvenile stage, we provide evidence of the feasibility of P. ferruginea restocking and reintroduction in the natural environment, recovering this species in this area, as expected from the ReLife project. Moreover, the reintroduction made from specimens obtained through aquaculture techniques, without substantially affecting donor populations, is also in accordance with the Spanish strategy for the conservation of the species (MMAMRM, 2008), and generally, repopulation actions through controlled reproduction, could allow in the future to repopulate other coastal areas, where populations of P. ferruginea are disappeared and/or in regression, for the recovery of the species at a global level.

Il progetto di dottorato è stato principalmente focalizzato sull’implementazione delle tecniche di riproduzione controllata nel genere Patella. Le specie oggetto di studio sono state P. caerulea e più in particolare P. ferruginea, specie protetta e in via di estinzione, il cui ripopolamento è oggetto del progetto europeo ReLife (LIFE15 NAT/IT/000771). Essendo P. ferruginea una specie protetta, inizialmente abbiamo preferito testare i trattamenti di induzione non letale su una specie cogenerica, P. caerulea, comune e abbondante lungo le coste italiane. I vari trattamenti testati hanno dato ottimi risultati, e il trattamento del “bubbling” è risultato il migliore, sia in termini di tempo di risposta alla stimolazione degli esemplari, sia perché si tratta di un metodo poco costoso e facilmente ripetibile. È stato possibile stilare un protocollo di spawning non letale, ed effettuare una fecondazione artificiale con successivo sviluppo larvale e insediamento dei giovanili (Ferranti et al., 2018). Inoltre, sono stati condotti dei monitoraggi lungo la costa ligure, che hanno permesso di riportare la presenza di esemplari di P. ferruginea, considerata estinta lungo queste coste (Espinosa et al., 2014). La distribuzione di P. ferruginea, lungo le coste liguri, è estremamente scarsa e frammentata, infatti la specie è stata rinvenuta come esemplari isolati o piccoli gruppi, come nell'AMP delle Cinque Terre. Questi ritrovamenti hanno però permesso di ampliare la mappatura della presenza di P. ferruginea lungo le coste del Mediterraneo (Ferranti et al., 2019). Inoltre, per comprendere meglio il ciclo riproduttivo e i tempi di rilascio dei gameti in P. ferruginea alle nostre latitudini, abbiamo posizionato degli esemplari in mare per la maturazione in condizioni naturali, fino all’inizio del periodo riproduttivo. Gli esemplari successivamente sono stati sottoposti a biopsia della gonade sia prima di essere messi in mare per determinare il sesso (Guallart et al., 2013a), che all'inizio del periodo riproduttivo previsto per comprendere lo stadio di maturazione. L’osservazione del materiale ottenuto tramite biopsia ha permesso di determinare che gli esemplari avevano raggiunto la maturazione gonadica e che uno di loro aveva effettuato il cambio di sesso, evento noto in letteratura, ma osservato qui per la prima volta alla latitudine del Mediterraneo nord-occidentale (Ferranti et al., 2021). Tali risultati implicano che la specie può completare il suo ciclo riproduttivo lungo le coste liguri. Sempre al fine di comprendere meglio i tempi di maturazione delle gonadi, abbiamo applicato le tecniche della Risonanza Magnetica su esemplari di patelle. La Risonanza Magnetica, attraverso un approccio non invasivo, ha permesso di osservare lo spessore della gonade e anche di capire se un esemplare avesse rilasciato o meno gameti, al fine di applicare eventualmente tecniche di stimolazione al rilascio dei gameti solo al momento giusto. I risultati indicano che la risonanza magnetica può essere molto utile come strumento aggiuntivo, sia per valutare la maturità sessuale di P. ferruginea, che per ridurre al minimo il numero di prove di induzione per ogni esemplare, e di conseguenza lo stress (Guallart et al., 2020). Ancora più rilevante è l'aver fornito l’evidenza, per la prima volta, che l’emissione delle uova può essere indotta in P. ferruginea e dimostrare che è possibile ottenere giovanili, in condizioni controllate, attraverso metodi non invasivi. Questi risultati hanno permesso di elaborare un protocollo preliminare sull'induzione all’emissione spontanea dei gameti da parte di P. ferruginea, senza sacrificare i riproduttori di una specie protetta. Inoltre, questo ci ha permesso di effettuare una fecondazione artificiale che ha portato allo sviluppo, insediamento, metamorfosi e crescita larvale di un numero piuttosto elevato di individui giovanili di P. ferruginea (Ferranti et al., in prep.). Di conseguenza, sapendo che la specie è presente lungo la costa ligure, che riesce a raggiungere la maturità anche a queste latitudini e che è possibile riprodurre P. ferruginea in condizioni controllate fino allo stadio giovanile, possiamo affermare che esiste la possibilità di ripopolamento e reintroduzione in ambiente naturale di esemplari di P. ferruginea, recuperando questa specie nell’area in oggetto, come previsto dal progetto ReLife. Inoltre, la reintroduzione realizzata da esemplari ottenuti mediante tecniche di acquacoltura, senza influenzare sostanzialmente le popolazioni donatrici, è anche in accordo con la strategia spagnola per la conservazione della specie (MMAMRM, 2008), e in generale, le azioni di ripopolamento attraverso la riproduzione controllata, potrebbero consentire in futuro di ripopolare altre aree costiere, dove le popolazioni di P. ferruginea sono scomparse e/o in regressione, per un recupero della specie a livello globale.