E’ noto da tempo l’importante ruolo biologico svolto dai glicosamminoglicani (GAGs), polisaccaridi in grado di interagire con una serie di fattori di crescita, citochine e componenti della matrice extracellulare modulandone l’attività, e in grado di partecipare alle principali fasi del processo di infezione batterica. Il progetto di dottorato si è incentrato sul ruolo dei GAGs in due patologie genetiche, una autosomica dominante e una autosomica recessiva, rispettivamente: Osteocondromi Multipli (OM) e Fibrosi Cistica (FC). Gli OM sono escrescenze ossee ricoperte da cartilagine che si formano in più punti dello scheletro a causa dell’errata regolazione del processo di ossificazione durante lo sviluppo causato da mutazioni nei geni EXT che codificano per glicosiltransferasi coinvolte nella biosintesi del GAG eparansolfato (HS), responsabile del corretto signaling durante l’osteogenesi. In letteratura sono riportate numerose indagini su cartilagine affetta da OM, ma nessuno studio strutturale sull’HS proveniente da tale cartilagine ed è dunque assente una correlazione genotipo-fenotipica. Il progetto di ricerca si è focalizzato sulla caratterizzazione strutturale dell’HS isolato sia da cartilagine umana sana proveniente da pazienti di diversa età, dallo stadio fetale a quello adulto, che da cartilagine patologica. La correlazione delle mutazioni nei geni EXT con la struttura dell’HS aiuterà ad individuare possibili biomarkers della malattia e della progressione maligna e fornirà indicazioni su una possibile terapia. 14 excisioni cartilaginee da individui sani, di cui 6 fetali, e 10 campioni patologici sono stati analizzati per il contenuto in HS. L’identificazione delle specie presenti ed i controlli delle fasi del lavoro sono avvenuti mediante spettroscopia NMR, che ha permesso di individuare tracce di HS in alcuni campioni. La caratterizzazione strutturale dell’HS è avvenuta tramite depolimerizzazione con enzimi specifici ed analisi HPLC-MS dei prodotti di digestione ed ha permesso di rilevare differenze composizionali nei diversi campioni analizzati. La FC è caratterizzata da mutazioni nel canale di trasporto del cloro CFTR, che causano scorretta traslocazione degli ioni cloro con conseguente accumulo di muco viscoso all’esterno delle cellule epiteliali polmonari, infiammazione persistente e infezione batterica cronica, portando infine a numerosi scompensi a livello sistemico. Due aspetti sono stati investigati: due serie di polisaccaridi, provenienti da modificazione chimica del GAG eparina (HEP), sono stati generati alla ricerca di composti con attività anti-infiammatoria, dapprima in vitro ed in seguito in vivo in un modello di infezione cronica indotta. La modificazione chimica dell’eparina ha comportato riduzione dell’attività anticoagulante e acquisizione di proprietà anti-infiammatorie, quali la capacità di inibire l’azione dell’elastasi e di interagire con interleuchina-8 e TNF-alfa, in vitro, e la diminuzione del numero di cellule totali e di TGF-beta nei lavaggi broncoalveolari in vivo, dimostrando così capacità di modulazione della risposta infiammatoria. Inoltre, si è valutata la modulazione dei GAGs in omogenati polmonari murini in presenza di infezione indotta da P.aeruginosa, uno dei principali patogeni rinvenuti nei polmoni di pazienti affetti dalla malattia, tramite isolamento e caratterizzazione dei GAGs presenti.

GLYCOSAMINOGLYCANS IN AUTOSOMAL GENETIC DISORDERS: INVESTIGATION ON MULTIPLE HEREDITARY EXOSTOSES AND CYSTIC FIBROSIS

VERALDI, NOEMI
2015

Abstract

E’ noto da tempo l’importante ruolo biologico svolto dai glicosamminoglicani (GAGs), polisaccaridi in grado di interagire con una serie di fattori di crescita, citochine e componenti della matrice extracellulare modulandone l’attività, e in grado di partecipare alle principali fasi del processo di infezione batterica. Il progetto di dottorato si è incentrato sul ruolo dei GAGs in due patologie genetiche, una autosomica dominante e una autosomica recessiva, rispettivamente: Osteocondromi Multipli (OM) e Fibrosi Cistica (FC). Gli OM sono escrescenze ossee ricoperte da cartilagine che si formano in più punti dello scheletro a causa dell’errata regolazione del processo di ossificazione durante lo sviluppo causato da mutazioni nei geni EXT che codificano per glicosiltransferasi coinvolte nella biosintesi del GAG eparansolfato (HS), responsabile del corretto signaling durante l’osteogenesi. In letteratura sono riportate numerose indagini su cartilagine affetta da OM, ma nessuno studio strutturale sull’HS proveniente da tale cartilagine ed è dunque assente una correlazione genotipo-fenotipica. Il progetto di ricerca si è focalizzato sulla caratterizzazione strutturale dell’HS isolato sia da cartilagine umana sana proveniente da pazienti di diversa età, dallo stadio fetale a quello adulto, che da cartilagine patologica. La correlazione delle mutazioni nei geni EXT con la struttura dell’HS aiuterà ad individuare possibili biomarkers della malattia e della progressione maligna e fornirà indicazioni su una possibile terapia. 14 excisioni cartilaginee da individui sani, di cui 6 fetali, e 10 campioni patologici sono stati analizzati per il contenuto in HS. L’identificazione delle specie presenti ed i controlli delle fasi del lavoro sono avvenuti mediante spettroscopia NMR, che ha permesso di individuare tracce di HS in alcuni campioni. La caratterizzazione strutturale dell’HS è avvenuta tramite depolimerizzazione con enzimi specifici ed analisi HPLC-MS dei prodotti di digestione ed ha permesso di rilevare differenze composizionali nei diversi campioni analizzati. La FC è caratterizzata da mutazioni nel canale di trasporto del cloro CFTR, che causano scorretta traslocazione degli ioni cloro con conseguente accumulo di muco viscoso all’esterno delle cellule epiteliali polmonari, infiammazione persistente e infezione batterica cronica, portando infine a numerosi scompensi a livello sistemico. Due aspetti sono stati investigati: due serie di polisaccaridi, provenienti da modificazione chimica del GAG eparina (HEP), sono stati generati alla ricerca di composti con attività anti-infiammatoria, dapprima in vitro ed in seguito in vivo in un modello di infezione cronica indotta. La modificazione chimica dell’eparina ha comportato riduzione dell’attività anticoagulante e acquisizione di proprietà anti-infiammatorie, quali la capacità di inibire l’azione dell’elastasi e di interagire con interleuchina-8 e TNF-alfa, in vitro, e la diminuzione del numero di cellule totali e di TGF-beta nei lavaggi broncoalveolari in vivo, dimostrando così capacità di modulazione della risposta infiammatoria. Inoltre, si è valutata la modulazione dei GAGs in omogenati polmonari murini in presenza di infezione indotta da P.aeruginosa, uno dei principali patogeni rinvenuti nei polmoni di pazienti affetti dalla malattia, tramite isolamento e caratterizzazione dei GAGs presenti.
13-feb-2015
Inglese
FRASCOTTI, GIANNI
Università degli Studi di Milano-Bicocca
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/73567
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIMIB-73567