Characterization of Moroccan Citrus Tristeza Virus (CTV) isolates and study of their genomic variability after aphid transmission

A survey of Citrus tristeza virus (CTV) was carried out in the main Moroccan citrus growing areas (Souss, Gharb, Moulouya, Tadla, Haouz and Loukkos), analyzing by DTBIA a total of 5192 plants. About 20% of the tested trees proved to be CTV-infected in the groves, mainly in Loukkos region with a 60% infection rate. On the contrary, only three CTV infected plants were found in Souss region and one plant in Gharb region. No CTV infection was detected in the surveyed nurseries, plots of budwood sources and varietal collections. CTV vectors were monitored in Gharb and Loukkos regions. Aphis spiraecola (56%) and A. gossypii (32%) were the most abundant aphid species, while no evidence of Toxoptera citricidus was reported. Ten out of 12 selected CTV isolates showed, by coat protein gene sequencing, the highest nucleotide similarity with the T30 mild reference strain (Florida) and the Spanish mild isolate T385, with a sequence homology ranging from 98.6% to 99.4%. The remaining isolates from Loukkos clustered close to the Portuguese 19-21 severe reference strain and to the Puerto Rican Poncirus trifoliata resistance breaking (RB) severe isolate B301 (98.5% to 99.2% homology); these two Moroccan isolates induced mild stem pitting symptoms on Duncan grapefruit by biological indexing and reacted positively to the MCA13 monoclonal antibodies. This study confirmed high CTV genetic diversity in some Moroccan citrus groves. The finding of the CTV stem pitting represents a serious threat to the Moroccan citrus industry, mainly if T. citricidus is introduced in the country. Meanwhile, aphid transmission experiments by A. gossypii and A. spiraecola on two local CTV isolates (mild and severe), were carried out in laboratory. The obtained results showed that A. gossypii was able to transmit efficiently the L-Clem2-Mor mild isolate (40%), while less was the transmission rate (13.33%) for the L-Clem1-Mor severe isolate whereas, the mild isolate was transmitted at a rate of 6.67% by A. spiraecola, which was not able to transmit the severe one. The transmission trials showed that the mild CTV isolate was more transmissible than the severe one; this may explain the prevalence of the mild isolate in the region of Loukkos. The field CTV isolates were compared to their correspondent aphid derived sub-isolates using SSCP and sequencing analysis of the p18, p23 and p25 genes. SSCP analysis showed that the CTV isolates had the same migration patterns as their correspondent aphid derived sub-isolates, whereas, sequencing analysis of the p18, p23 and p25 genes revealed minor changes in the sequences obtained from aphid derived sub-isolates compared to their parental field isolates. Consequently, very limited changes where registered in the corresponding predicted amino acids sequences of the studied genes. Finally, a Tissue Print (TP) real time RT-PCR assay for a rapid differentiation and identification of potential severe strains of CTV was developed and validated for testing a panel of 15 CTV isolates from the Mediterranean area; the obtained results confirmed their corresponding genotypes. This assay was equally used to test 12 CTV sources from Morocco; interestingly, the two severe isolates that induced previously mild stem pitting on Duncan grapefruit were assigned as a T36-like genotype through this assay.

Un indagine sul Citrus tristeza virus (CTV) è stata condotta nelle principali aree agrumicole del Marocco (Souss, Gharb, Moulouya, Tadla, Haouz e Loukkos), analizzando con il DTBIA una totalità di 5192 piante di agrumi. Nei campi commerciali, soprattutto nell'area di Loukkos, sono risultate infette al CTV circa il 20% delle piante saggiate, con un incidenza d infezione pari al 60%. Al contrario, solo tre piante sono risultate infette nella regione di Souss ed una in quella di Gharb. Nessuna infezione del virus è stata riscontrata nei vivai, nei campi di piante madri e nelle collezioni varietali. Dalle indagini condotte sui vettori del CTV nelle regioni di Gharb e Loukkos è emerso che A. spiraecola (56%) e A. gossypii (32%) sono le specie afidiche più presenti, mentre non è stata evidenziata la presenza della T. citricidus. Attraverso il sequenziamento della proteina, dieci dei 12 isolati selezionati di CTV hanno mostrato una omologia variabile dal 98.6 al 99.4% con i ceppi tenui di riferimento T30 (Florida) e T385 (Spagna). Gli isolati rimanenti provenienti da Loukkos sono stati raggruppati con il ceppo severo Portoghese 19-21 e con quello del Porto Rico B301 (con un omologia variabile dal 98.5 al 99.2%); questi due isolati Marocchini hanno indotto, durante i saggi per innesto, sintomi di lieve butteratura del legno sul pompelmo Duncan ed hanno reagito positivamente agli anticorpi monoclonali MCA13. Questo studio conferma l'alta diversità genetica degli isolati di CTV provenienti da alcuni agrumeti del Marocco. Il ritrovamento del ceppo di CTV-butteratura del legno rappresenta un serio rischio per l'industria agrumicola del Marocco, soprattutto se nel Paese farà il suo ingresso la T. citricidus. Contestualmente, sono state condotte prove di trasmissione di due isolati locali di CTV (uno tenue ed uno severo) attraverso A. gossypii e A. spiraecola. I risultati ottenuti hanno mostrato una trasmissione attraverso A. gossypii del 40% dell'isolato tenue di CTV rispetto al 13,33% dell'isolato severo, mentre attraverso A. spiraecola è stato trasmesso solo l'isolato tenue di CTV (6.67%) e non quello severo; questo risultato spiega la prevalenza dell'isolato tenue di CTV nella regione di Loukkos. Gli isolati di CTV selezionati in campo sono stati comparati con il loro corrispondenti sub-isolati derivati dalla trasmissione per afide attraverso le analisi SSCP ed il sequenziamento dei geni p18, p23 e p25. Le analisi SSCP hanno evidenziato che gli isolati di CTV hanno gli stessi profili di migrazione dei loro corrispondenti sub-isolati derivati dall'afide, mentre il sequenziamento dei geni p18, p23 e p25 ha mostrato minori cambiamenti nelle sequenze ottenute dai sub-isolati derivati dagli afidi rispetto agli isolati originari dal campo. Pochissimi cambiamenti sono stati quindi registrati nelle corrispondenti sequenze degli amminoacidi dei geni studiati. In fine, è stata sviluppata la tecnica di Tissue Print (TP) real time RT-PCR per la rapida differenzazione ed identificazione dei potenziali ceppi severi di CTV. Questa tecnica è stata utilizzata per analizzare un gruppo di 15 isolati di CTV dell'area Mediterranea ed i risultati ottenuti hanno confermato la loro corrispondenza genotipica. Questo saggio è stato egualmente utilizzato per analizzare 12 fonti di CTV del Marocco ed ha permesso di attribuire ai due isolati severi, che avevano indotto la formazione di una lieve butteratura del legno nel pompelmo Duncan, una similitudine al genotipo T36.