ELUCIDATING THE ROLE OF PROMYELOCYTIC LEUKEMIA GENE IN CLEAR CELL RENAL CELL CARCINOMA

Il Carcinoma renale a cellule chiare è il tipo più comune di RCC (Carcinomi a Cellule Renali), rappresentando il 75% di tutti i casi. Si stima che il 50% dei pazienti sviluppi metastasi entro 3-30 anni dopo l'asportazione del tumore. La maggior parte dei pazienti con metastasi sviluppa resistenza al trattamento, pertanto è urgente la necessità di nuovi trattamenti. Farmaci emergenti recenti includono inibitori di HIF2⍺, un fattore indotto da ipossia il cui espressione è de-regolata nel ccRCC (Carcinoma renale a cellule chiare). I risultati preliminari dal nostro laboratorio suggeriscono che il gene PML è sovra-espresso nel RCC e che è correlato a una cattiva prognosi. Qui, il ruolo di PML come oncogene è stato ulteriormente testato mediante analisi bioinformatica e studi in vitro. Abbiamo scoperto che il silenziamento di PML induce un arresto della crescita stabile e dipendente da p53. Inoltre, utilizzando il saggio SA-b-gal, abbiamo mostrato che il knockdown di PML fa entrare le cellule ccRCC in senescenza dopo un silenziamento prolungato di PML. Eseguendo il sequenziamento dell'RNA su cellule RCC4 silenziate per PML, abbiamo confermato i fenotipi osservati in vitro e in vivo dopo il silenziamento di PML e abbiamo identificato geni positivamente regolati da HIF2⍺. Ciò ci ha portato a ipotizzare che PML regoli la proliferazione del ccRCC attraverso HIF2⍺. Tuttavia, la sovra-espressione di HIF2⍺ nelle cellule silenziate per PML non è riuscita a invertire il fenotipo. Infine, abbiamo indagato sulla rete trascrizionale regolata dopo il silenziamento di PML e identificato diversi fattori di trascrizione i cui elementi responsivi sono arricchiti nei geni regolati da PML. Tra questi geni, abbiamo osservato un arricchimento di siti di legame SP1. Poiché SP1 è un noto interattore sia di PML che di p53, abbiamo testato una possibile interazione con PML nelle cellule ccRCC. Attraverso la doppia immunofluorescenza, abbiamo dimostrato la colocalizzazione spaziale di SP1 e PML e proposto SP1 come candidato valido da testare per il suo coinvolgimento nella regolazione della senescenza mediata da p53.

Clear cell Renal Cell Carcinoma is the most common type of RCCs accounting for 75 % of all cases. It has been estimated that 50 % of patients develop metastasis within 3 to 30 years after tumor removal. The majority of the patients with metastasis develop treatment resistance, therefore the urge of new treatment is imminent. Recent emerging drugs include inhibitors of HIF2⍺, a hypoxia-induced factor whose expression is deregulated in ccRCC. Preliminary results from our laboratory suggested that PML is overexpressed in RCC and that it correlated with poor prognosis. Here the role of PML as an oncogene was further tested by bioinformatics analysis and in vitro studies. We found that PML silencing induced a stable and p53-dependent growth arrest. Moreover, by using SA-b-gal assay we showed that knocking down PML caused ccRCC cells to enter senescence after long term PML silencing. By performing RNA sequencing on PML-silenced RCC4 cells we confirmed the phenotypes observed in vitro and in vivo upon PML silencing and we identified genes that are positively regulated by HIF2⍺. This prompted us to hypothesize that PML regulates ccRCC proliferation through HIF2⍺. However, overexpression of HIF2⍺ in PML-silenced cells failed to reverse the phenotype. Finally, we interrogated the transcriptional network regulated upon PML silencing and identified a number of transcription factors whose responsive elements are enriched in PML-regulated genes. Within these genes, we observed an enrichment of SP1 binding sites. Because SP1 is a known interactor of both PML and p53 we tested a possible interaction with PML in ccRCC cells. By double immunofluorescence, we demonstrated spatial colocalization of SP1 and PML and proposed SP1 as a valid candidate to be tested for its involvement in the regulation of p53-mediated senescence.