Development of chimeric lysosomal enzymes with improved bioavailability to advance gene therapy strategies for globoid cell leukodystrophy

La leucodistrofia a cellule globoidi (GLD) è una malattia neurodegenerativa da accumulo lisosomiale (LSD) dovuta alla carenza genetica di ß-galattosilceramidasi (GALC). Le forme infantili sono le più frequenti e mostrano una progressione inarrestabile con un grave deterioramento neurologico centrale e periferico. L'unica opzione terapeutica è il trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPC-T), sebbene sia scarsamente efficace. Pertanto, la GLD è considerata un disturbo non curabile. La terapia genica (GT) fornisce un beneficio terapeutico in altre LSD che condividono con la GLD il grave e rapido deterioramento del sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, negli studi preclinici sulla GLD è stato ottenuto solo un beneficio moderato e nessuno di essi è stato in grado di arrestare questa rapida e complessa patologia multiorgano. Studi precedenti hanno dimostrato che le modifiche alla sequenza degli enzimi lisosomiali per aumentarne la secrezione e la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) aumentano l'efficacia della GT in diversi modelli animali di LSD. Pertanto, l'uso di un enzima chimerico GALC simile potrebbe essere cruciale per aumentare la biodisponibilità di GALC e il successo della GT. Abbiamo generato vettori lentivirali (LV) che codificano per l'enzima GALC murino fuso con il reporter fluorescente mCherry e lo abbiamo ingegnerizzato mediante: i) sostituendo il peptide segnale (sp) di GALC con quello di enzimi lisosomiali altamente secreti (iduronato-2-solfatasi -IDS- o -L-iduronidasi -IDUA-) per aumentare la secrezione di GALC; ii) aggiungendo un peptide del dominio di legame del recettore delle lipoproteine a bassa densità per migliorare l'attraversamento della BBB. Abbiamo testato i LV in cellule staminali/progenitrici neurali ed ematopoietiche GLD murine e nella loro progenie, tipi di cellule rilevanti nel contesto delle piattaforme GT. Abbiamo dimostrato la sovraespressione sicura e l'attività enzimatica degli enzimi GALC chimerici in cellule GLD trasdotte, con un vantaggio in termini di produzione e secrezione di GALC dato dall'IDSsp e ancor più dall'IDUAsp. Gli enzimi chimerici sono stati secreti dalle cellule trasdotte e ricatturati dalle cellule neurali con deficit di GALC, mediando la degradazione degli accumuli di galattosilceramide tramite correzione incrociata. Questi risultati supportano fortemente il razionale di testare la sicurezza e l'efficacia degli enzimi GALC chimerici negli approcci HSPC-GT mediati da LV in topi GLD neonati. A tal fine, abbiamo confrontato Busulfan e l'irradiazione corporea totale come regimi di condizionamento mieloablativo in questo difficile modello murino e abbiamo selezionato un protocollo che è stato applicato in esperimenti preliminari per testare la sicurezza e l'efficacia degli approcci di HSPC-GT utilizzando il costrutto chimerico GALC ottimizzato. L'obiettivo finale di questo progetto è sviluppare strategie di GT nuove e più efficaci per questa malattia non curabile.

Globoid cell leukodystrophy (GLD) is a neurodegenerative lysosomal storage disease (LSD) due to the genetic deficiency of ß-galactosylceramidase (GALC). The most frequent infantile forms display an unrelenting progression with a severe central and peripheral neurological deterioration. The only treatment option is the hematopoietic stem/progenitor cell transplant (HSPC-T), although this is poorly effective. Thus, GLD is considered an untreatable disorder. Gene therapy (GT) provides therapeutic benefit in other LSDs that share with GLD the severe and rapid central nervous system (CNS) deterioration. However, only moderate benefit was obtained in preclinical studies for GLD and none of them was able to halt this rapid and complex multi-organ pathology. Previous studies showed that modifications to the lysosomal enzymes sequence to enhance their secretion and capability to cross the blood brain barrier (BBB) boost the GT efficacy in different animal models of LSDs. Thus, the use of a similar chimeric GALC enzyme may be crucial to successfully increase the GALC bioavailability and GT success. We generated lentiviral vectors (LVs) encoding for the murine GALC enzyme fused with the mCherry fluorescent reporter and we engineered it by: i) replacing the GALC signal peptide (sp) with that of highly secreted lysosomal enzymes (iduronate-2-sulphatase -IDS- or -L-iduronidase -IDUA-) to increase GALC secretion; ii) adding a low-density lipoprotein receptor binding domain peptide to enhance BBB crossing. We tested generated LVs in murine GLD neural and hematopoietic stem/progenitor cells and progeny, relevant cell types in the context of GT platforms. We showed safe overexpression and enzymatic activity of chimeric GALC enzymes in transduced GLD cells, with an advantage in terms of GALC production and secretion given by the IDSsp and even more by the IDUAsp. The chimeric enzymes were secreted by transduced cells and recaptured by GALC-deficient neural cells, mediating clearance of galactosylceramide storage in cross-corrected cells. These results strongly support the rationale of testing the safety and efficacy of chimeric GALC enzymes in LV-mediated HSPC-GT approaches in neonatal GLD mice. To this end, we compared Busulfan and total body irradiation as myeloablative conditioning regimens in this challenging murine model and selected a protocol that has been applied in preliminary experiments to test the safety and efficacy of HSPC-GT approaches using the optimized GALC chimeric construct. The final goal of this project is to develop novel and more effective GT strategies for this untreatable disease.