Kevetrin: preclinical study of activity and molecular mechanisms of a new promising molecule in Acute Myeloid Leukemia

La leucemia mieloide acuta (LMA) è un disordine eterogeneo caratterizzato dall’espansione clonale di progenitori mieloidi a livello di midollo osseo e sangue periferico. La LMA è attualmente curabile in circa il 35% - 40% di pazienti con età inferiore ai 60 anni e nel 5% - 15% di pazienti con età superiore a 60. I geni mutati in maniera significativa nella LMA sono stati organizzati in otto categorie funzionali, tra le quali è possibile distinguere la categoria dei geni Onco-soppressori, come il gene codificante per la proteina tumorale p53 (TP53). TP53 è mutato nell’8% - 14% dei casi di pazienti con LMA; la sua mutazione è in genere associata ad un cariotipo complesso e conferisce una prognosi molto sfavorevole con chemioresistenza. Il Kevetrin è un nuovo composto, formulato dalla Cellceutix, che è stato ampiamente studiato (in vitro ed in vivo), dimostrando una forte attività in varie tipologie tumorali. Il meccanismo d’azione del Kevetrin coinvolge la proteina p53 con un ruolo duale: è responsabile dell’attivazione della proteina wild type e della degradazione della forma mutata di p53, promuovendo l’apoptosi. Abbiamo quindi deciso di indagare le alterazioni cellulari e molecolari indotte dal Kevetrin in due linee cellulari di LMA, caratterizzate da un diverso stato mutazionale del gene TP53, al fine di chiarire il meccanismo d’azione del farmaco nel nostro modello. Dai nostri risultati la linea cellulare TP53 mutata (KASUMI-1) presenta un effetto del farmaco dose e tempo-dipendente, con un aumento statisticamente significativo dell’apoptosi, della frammentazione del DNA, della depolarizzazione della membrana mitocondriale e dell'attivazione delle Caspasi-3 nei campioni trattati rispetto ai controlli non soggetti a trattamento, dopo 24 e 48 ore. D’altra parte nella linea cellulare TP53 wild type (MOLM-13) è possibile osservare un effetto del farmaco esclusivamente dopo 48 h di trattamento alla concentrazione più elevata. Abbiamo studiato il meccanismo d’azione del composto dal punto di vista molecolare e, anche in questo caso, abbiamo riscontrato una differenza tra le due linee cellulari in termini di livelli proteici di p53 e delle proteine ad essa correlate, come p21, PUMA, Sirtuin-3 e Hsp90. Inoltre, abbiamo studiato l'effetto del farmaco in seguito ad un trattamento pulsato, costituito da un’infusione di 6 ore seguita da un wash out di 66 ore, al fine di riprodurre quanto più fedelmente possibile lo schema terapeutico del protocollo clinico disegnato per i pazienti con LMA (ad oggi non ancora iniziato), ma abbiamo riscontrato un’attività del farmaco meno marcata, rispetto al trattamento in continuo. Il nostro studio mostra come il Kevetrin sia attivo sia nei modelli TP53 wild type che mutati, suggerendo la molecola come un nuovo promettente agente terapeutico nel trattamento della LMA.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disorder characterized by clonal expansion of myeloid progenitors in the bone marrow and peripheral blood. AML is now cured in approximately 35% – 40% of patients younger than 60 years old and in 5% - 15% of patients who are older than 60 years of age. AML significantly mutated genes have been organized into eight functional categories among which we can discern Tumor-suppressor genes, like the Tumor protein p53 (TP53). TP53 gene is mutated in 8% - 14% of AML cases; its mutation is normally associated with complex karyotype and confer a very adverse prognosis with documented chemoresistance. Kevetrin is a new molecule compound, proposed by Cellceutix, that has been studied extensively (in vitro and in vivo) demonstrating a potent activity against various cancer types. Kevetrin mechanism of action involve the p53 protein with a dual role: it can activate wild type and degrade oncogenic mutant p53, inducing apoptosis. We therefore set out to investigate the cellular and molecular alterations induced by Kevetrin in two AML cell lines, characterized by a different TP53 gene mutational status, in order to clarify the drug’s mechanism of action in our model. From our findings the TP53 mutated cell line (KASUMI-1) showed a dose and time-dependent effect of the molecule, with a statistically significant increase of apoptosis, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization and Caspase-3 activation in treated samples compared to no drug control, after 24 and 48 hours of treatment. On the other side, in the TP53 wild type cell line (MOLM-13) we observed an effect of the drug solely at the higher concentration, after 48 hours of treatment. We investigated the molecular mechanism of action of the compound and, also in this case, we found a difference between the two cell lines in terms of protein levels of p53 and its related proteins, like p21, PUMA, Sirtuin-3 or Hsp90. Moreover, we investigated the effect of the drug after a pulsed treatment, consisting in the infusion of 6 hours plus a wash out of 66 hours, in order to reproduce more closely the clinical protocol designed for AML patients (not started yet), but we found a less marked activity of the molecule, compared to the continuous treatment. Our study demonstrates that Kevetrin has an activity in both TP53 wild type and mutated models, suggesting the molecule as a promising new agent in the treatment of AML.