Cellular and animal ALS models: studies on TDP-43 aggregate clearance

The absence of a curative therapy for Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is in part due to the lack of models that faithfully recapitulate ALS phenotypes to use in studies of ALS drug development. TDP-43 aggregation in motor neurons is the main histologic feature of ALS. Irrespectively of the exact role of the aggregates, their eventual reduction represents an important therapeutic pathway, either by removal of the potential intrinsic toxicity or by elimination of self-templating conformers that can sequester endogenous TDP-43 into the aggregates resulting in lack of its soluble and functional form. In this thesis, I create and characterize a new cellular model, developed with the aim of using it in a high throughput phenotypic screen to identify new therapeutic compounds that, by reducing TDP-43 inclusions, could revert the ALS-symptoms. I demonstrate that the cellular model results in efficient aggregation of endogenous TDP-43 and concomitant loss of function in splicing regulation. I provide a proof of principle for its eventual use in high throughput screening with 5 tricyclic compounds that enhance removal of the aggregates and demonstrate that this translates to functional recovery of TDP-43. Initial studies into the mechanism of action indicate that aggregate clearance is occurring through the UPS pathway and not autophagy, suggesting that the UPS could be a target of new therapeutic approaches. More than 10 thousand compounds were tested in this cellular model. Top hit compounds, able to clear aggregates from the cell, were also tested for their ability to rescue TDP-43 loss-of-splicing function. Subsequently, 5 compounds deriving from the high throughput screen were tested in a Drosophila model expressing the same aggregate inducer (TDPF4L12xQ/N) created and characterized in this thesis, that present an age related locomotive phenotype. Two of these were able to improve significantly the climbing ability of the transgenic fly when compared with untreated flies, providing not only a proof of concept that small molecules can revert the ALS phenotype but also that the cellular model utilised in the screen for candidate molecules is a good tool to identify chemical probes leading to aggregate clearance. Follow up of studies on the compounds and understanding of their mechanisms of action will prove beneficial to advance research on a variety of neurodegenerative diseases where aggregates formation occurs.

L’assenza di una terapia efficace per la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è in parte dovuta alla mancanza di modelli in grado di riprodurre fedelmente il fenotipo della malattia da utilizzare per lo sviluppo di nuovi farmaci. Gli aggregati di TDP-43 nei motoneuroni sono la principale caratteristica istologica della SLA. Indipendentemente dal ruolo preciso degli aggregati, la loro riduzione rappresenta un beneficio nel percorso terapeutico, sia per la rimozione di una possibile tossicità intrinseca agli aggregati, sia per la riduzione della possibilità di sequestro della TDP-43 endogena all’interno degli aggregati stessi che limiterebbe la disponibilità della sua forma solubile e funzionale all’interno della cellula. In questa tesi è stato creato e caratterizzato un nuovo modello cellulare di aggregazione patologica di TDP-43 (basato sull’espressione inducibile di una TDP-43 transgenica modificata in modo tale da aggregare facilmente) con l’obiettivo di usarlo in uno screening con tecnologia high-throughput per identificare nuovi composti in grado di ridurre gli aggregati di TDP-43 e, di conseguenza, di migliorare i sintomi tipici della SLA. E’ stato dimostrato che il modello cellulare creato è, in effetti, in grado di formare aggregati patologici e di provocare il sequestro della TDP-43 endogena causandone la perdita di funzionalità, quest’ultima confermata attraverso l’analisi dello splicing di uno dei target di TDP-43. Inizialmente sono stati testati cinque diversi composti appartenenti alla famiglia dei composti triciclici ed è stato visto che questi composti causano una significativa riduzione degli aggregati accompagnata dal recupero del normale profilo di splicing del target di TDP-43, dimostrando che l’eliminazione degli aggregati è strettamente collegata con il recupero della funzionalità di TDP-43. Studi preliminari per quanto riguarda il meccanismo di azione di questi composti indicano che la rimozione degli aggregati avviene attraverso il proteosoma, aprendo la strada ad un nuovo possibile percorso terapeutico. In seguito, oltre 10’000 composti sono stati testati sullo stesso modello cellulare. I migliori, in termini di rimozione degli aggregati, sono stati testati anche per quanto riguarda la loro capacità di ripristinare la funzionalità della TDP-43 endogena. Cinque composti tra questi sono stati in seguito testati in un modello di Drosophila melanogaster creato e caratterizzato in questo lavoro, che esprime la stessa TDP-43 transgenica utilizzata per la creazione del modello cellulare e che presenta un chiaro fenotipo motorio. In seguito al trattamento con due tra questi composti, le capacità motorie del nostro modello animale sono migliorate in maniera significativa, dimostrando che questo tipo di composti chimici sono in grado di migliorare il fenotipo tipico della SLA e che il modello cellulare utilizzato in questo studio è valido per identificare nuovi composti capaci di ridurre gli aggregati di TDP-43. Ulteriori studi su questi composti e sul loro meccanismo d’azione potrebbero costituire un grande passo in avanti per la ricerca che si occupa di altre malattie neurodegenerative anch’esse caratterizzate da un accumulo patologico di proteine all’interno della cellula.