Promoter proximal U1snRNP-dependent pre-mRNA processing defects in human coagulation factor 7 deficiency

Lo U1 snRNP (small nuclear RiboNuclear Particle) e’ una particella fondamentale presente nello spliceosoma ed è coinvolto in diverse fasi del processamento del precursore dell’ RNA (pre-mRNA) tra cui lo splicing e la poliadenilazione. Mutazioni nel sito di splicing donatore sugli esoni interni possono ridurre il legame dello U1 snRNP sul pre-mRNA inducendo difetti di splicingcon salto dell’esone. Questi difetti possono essere recuperati da U1 snRNA modificati che si legano al sito del donatore difettoso o alle sequenze introniche a valle. Tuttavia, mutazioni che interessano il sito di splicing 5’ localizzato nel primo esone e quindi prossimale al promotore (Promoter Proximal 5’ss o pp 5'ss) sono state poco studiate. In questo lavoro, usando come modello mutazioni localizzate al pp 5 'ss nel fattore di coagulazione 7 (F7), ho studiato come queste varianti associate alla malattia influenzano il processamento del pre-mRNA ed inoltre il potenziale terapeutico di U1 RNA modificati. L'analisi è stata eseguita utilizzando diversi minigeni corrispondenti al F7, transfettati in modo transiente o cromosomicamente integrati nelle cellule T-REx di Flp-In ™ 293, sui quali ho valutato l'effetto delle mutazioni pp 5'ss sullo splicing e sulla selezione di siti di poliadenilazione alternativi. Esperimenti coi minigeni hanno dimostrato che le mutazioni di pp 5'ss, in base alla forza residua del sito donatore, hanno un effetto negativo sullo splicing riducendo drasticamente la quantità di trascritti processati. Tale effetto e’ risultato evidente nelle frazioni cellulari cromatiniche, nucleoplasmatiche e citoplasmatiche. Inoltre, nei costrutti che contengono un ulteriore sito di poliadenilazione alternativo, i mutanti al pp 5 'ss hanno promosso l'utilizzo del sito prossimale di poliademilazione. Inoltre, la lunghezza del primo introne accentua questi difetti riducendo ulteriormente lo splicing e la selezione del sito di poliadenilazione prossimale. Questo effetto dipendente dalla lunghezza del primo introne suggerisce che la forza del pp 5’ potrebbe anche influenzare la processività della RNAPII. Nei diversi sistemi sperimentali utilizzati, la espressione di U1 modificati ha recuperato i difetti di processamento del pre-mRNA ed, in un minigene competente per lo splicing, ha recuperato l'attività della proteina F7. Attraverso lo studio di varianti di U1 snRNA modificate, e’ stao inoltre possibile identificare due elementi strutturali, la proteina 70K e il la quarta struttura a forcina della RNA (stem loop 4), che sono importanti sia per l'aumento dello splicing che per la poliadenilazione. Al contrario la proteina U1-A e’ risulta non importante in questi due eventi. Inoltre, in due minigeni associati all'atrofia muscolare spinale e alle condrodisplasie, U1 modificati che si legano ai corrispondenti pp 5'ss erano in grado di aumentare i trascritti. I miei risultati indicano che le mutazioni che colpiscono i pp 5'ss influenzano il legame con lo U1 snRNP e questa particella, principalmente attraverso il loop 4 e la proteina 70K, è coinvolta nel corretto processamento del pre-mRNA. Le mutazioni di pp 5’ riducono drasticamente i trascritti soggetti a splicing e possono anche attivare potenziali siti di poliadenilazione criptici nel primo introne. Poiché gli snRNA U1 modificati che si legano al sito del donatore difettoso o alle sequenze introniche a valle recuperano in modo efficiente i difetti di base, queste particelle possono rappresentare una nuova strategia terapeutica utile per la correzione delle mutazioni che influenzano i pp 5'ss.

U1 snRNP is a core component of the spliceosome involved in different pre-mRNA processing steps, including splicing and polyadenylation. Donor splice site mutations on internal exons reducing U1 snRNP binding on pre-mRNA have been shown to induce splicing defects. These can be recovered by modified U1 snRNAs that bind either at the defective donor site or at downstream intronic sequences. However, very few studies focused on promoter proximal 5’ splice site (pp 5’ss) mutations. In this work, using as a model disease-associated mutations at the pp 5’ss in coagulation Factor 7 (F7), I have studied how these variants affect pre-mRNA processing as well as the therapeutic potential of modified U1 RNAs. The analysis was performed using different F7 minigene model systems, either transiently transfected or chromosomally integrated in Flp-In™ 293 T-REx cells where I evaluated the effect of the pp 5’ss mutations on splicing and alternative polyadenylation selection. Minigene experiments showed that the pp 5’ss mutations, according to the residual strength of the donor site, have a negative effect on splicing, severely reducing the amount processed transcripts. This effect was evident in chromatin, nucleoplasmic and cytoplasmic cellular fractions. In addition, in constructs with an additional artificial polyadenylation site, the pp 5’ ss mutants promoted the utilization of the proximal polyA site. Interestingly, the length of the first intron increases the defect caused by the pp 5’ss mutations, reducing splicing and promoting the selection of the proximal polyadenylation site. This length-dependent effect suggests that the strength of the pp 5’ might also affect RNAPII processivity. Expression of modified U1s rescued the pp 5’ss defects in the different experimental systems, and recovered the F7 protein activity in a splicing competent minigene. Using modified U1 snRNAs variants, I show that two structural elements that constitute the particle, the 70K protein and the stem loop 4 are important both for splicing enhancement and polyadenylation, whereas the U1-A protein is mainly dispensable. Furthermore, in two unrelated minigenes associated to spinal muscular atrophy and chondrodysplasias, modified U1s that bind to their corresponding pp 5’ss were able to increase the spliced transcripts. My results indicate that mutations at pp 5’ss affect U1 snRNP binding and this particle, mainly through stem loop 4 and 70K, is involved in correct processing of the pre-mRNAs. Pp 5’ss mutations severely reduce the splicing transcripts and can also activate potential cryptic polyadenylation sites in the first intron. As modified U1 snRNAs that bind either at the defective donor site or at downstream intronic sequences rescue these defects, these particles represent a novel therapeutic strategy for the correction of mutations that affect the pp 5’ss.