Membrane di nanofibre di Chitosano puro e Chitosano/Idrossiapatite per applicazioni ortopediche, realizzate con elettrospinning: caratterizzazione dei biomateriali e biocompatibilità su cellule staminali umane

Introduction Electrospinning is a technique dedicated to the manufacture of nanofibrosis materials starting from polymeric solutions that migrate within an electric field. Among the new biomaterials, chitosan is regarded as one of the most interesting polymers for cartilage and bone tissue engineering applications. When chitosan is processed through the electrospinning technique, the fibers produced have defects or "beads". The aim of the present work is the realization of new biocompatible scaffolds based on pure chitosan or with hydroxyapatite using the electrospinning technique. The experimental work, in addition to the realization of the biomaterials, was aimed at the optimization of the production process, their complete characterization, and the evaluation of biocompatibility tests on human mesenchymal stem cells for potential tissue engineering applications of the locomotor system. Materials and methods The starting polymeric solution was made by dissolving medium molecular weight chitosan in a trifluoroacetic acid / dichloromethane solution. Some membranes have been functionalized by adding hydroxyapatite nanopowders at concentrations of 5% and 10% W / W. The electrospinning of these solutions was carried out with electric field parameters of 1 kV / cm, and a speed of 0.1 mL / h. Subsequently, the samples were cross-linked with glutaraldehyde vapors, and characterized by scanning electron microscope (FE-SEM) and spectrophotometric analysis (ATR / FTIR). Biocompatibility tests were performed on human stem cells for the evaluation of cytotoxicity and cell proliferation. Results The micrographs obtained by SEM analysis showed membranes of pure electro-spun CS nanofibers as a network of fine fibers, randomly directed, without defects or beads, with an average diameter of 450 ± 110 nm. The crosslinking process did not modify the morphology of the fibers and their average diameter (440 ± 210 nm). In the samples functionalized with hydroxyapatite, a decrease in the average diameter of the fibers with an average diameter of 200 ± 50 nm was observed, and with the presence of HA nanoparticles on the nanofibers. The ATR / FTIR analysis confirmed the crosslinking, and excluded the presence of toxic residues of cosolvents (trifluoroacetic acid and dichloromethane) and free glutataldehyde, which would have contraindicated the possibility of using the scaffolds for tissue engineering applications. It also confirmed the presence of hydroxyapatite in the chitosan membrane. In the cytotoxicity tests, cell survival on both cross-linked electrospun membranes, both of pure chitosan and functionalized with HA, was greater than 90%. Similarly, in the cell proliferation test in culture with both membranes there was a progressive increase in the number of cells in culture. Discussion and conclusions In the present work, a standardizable and reproducible technique was optimized to produce cross-linked membranes of pure chitosan nanofibers or composite with hydroxyapatite. The process does not use copolymers to improve the processability of the polymer by electrospinning, but is based on a system of cosolvents. The obtained membranes were characterized in terms of morphology and chemical structure. Their biocompatibility was tested on hMSCs and the results confirmed that the electrospun membranes are biocompatible and therefore potential candidates for stem cell applications in regenerative medicine.

Introduzione L'Electrospinning è una tecnica deputata alla fabbricazione di materiali nanofibrosi a partire da soluzioni polimeriche che migrano all'interno di un campo elettrico. Fra i nuovi biomateriali, il chitosano è considerato come uno dei polimeri più interessanti per le applicazioni di ingegneria tissutale della cartilagine e dell'osso. Quando il chitosano è processato tramite la tecnica dell'electrospinning, le fibre prodotte presentano difetti o "beads". Obiettivo del presente lavoro è la realizzazione di nuovi scaffold biocompatibili a base di chitosano puro o con idrossiapatite tramite la tecnica dell'electrospinning. Il lavoro sperimentale, oltre alla realizzazione dei biomateriali, è stato volto all'ottimizzazione del processo di produzione, alla loro completa caratterizzazione, ed alla valutazione delle prove di biocompatibilità su cellule staminali mesenchimali umane per potenziali applicazioni di ingegneria tissutale dell'apparato locomotore. Materiali e metodi La soluzione polimerica di partenza è stata realizzata sciogliendo chitosano di medio peso molecolare in una soluzione di acido trifluoroacetico/diclorometano. Alcune membrane sono state funzionalizzate tramite aggiunta di nanopolveri di idrossiapatite a concentrazioni del 5% e del 10%W/W. L'electrospinning di dette soluzioni è stato effettuato con parametri di campo elettrico di 1 kV/cm, e velocità di 0.1 mL/h. In seguito i campioni sono stati sottoposti a reticolazione con vapori di glutaraldeide, e caratterizzati tramite analisi al microscopio elettronico a scansione (FE-SEM) e tramite analisi spettrofotometrica (ATR/FTIR). Le prove di biocompatibilità sono state effettuate su cellule staminali umane per valutazione della citotossicità e proliferazione cellulare. Risultati Le micrografie ottenute tramite analisi SEM hanno mostrato membrane di nanofibre di CS puro elettrofilato come una rete di fibre sottili, a direzione randomica, senza difetti o beads, con diametro medio di 450 ± 110 nm. Il processo di reticolazione non ha modificato la morfologia delle fibre ed il loro diametro medio (440 ± 210 nm). Nei campioni funzionalizzati con idrossiapatite si è osservata una diminuzione del diametro medio delle fibre con diametro medio di 200 ± 50 nm, e con presenza di nanoparticelle di HA sulle nanofibre. L'analisi ATR/FTIR ha confermato l'avvenuta reticolazione, ed escluso la presenza di residui tossici dei cosolventi (acido trifluoroacetico e diclorometano) e di glutataldeide libera, che avrebbero controindicato la possibilità di utilizzare gli scaffold per applicazioni di ingegneria tissutale. Inoltre ha confermato la presenza dell'idrossiapatite nella membrana di chitosano. Alle prove di citotossicità la sopravvivenza cellulare su entrambe le membrane elettrofilate reticolate, sia di chitosano puro che funzionalizzato con HA, è stata maggiore del 90%. Analogamente, nel test di proliferazione cellulare in coltura con entrambe le membrane si è assistito ad un aumento progressivo del numero di cellule in coltura. Discussione e Conclusioni Nel presente lavoro è stata ottimizzata una tecnica standardizzabile e riproducibile per produrre membrane reticolate di nanofibre di chitosano puro o composite con idrossiapatite. Il processo non utilizza copolimeri per migliorare la processabilità del polimero mediante elettrofilatura, ma si basa su di un sistema di cosolventi. Le membrane ottenute sono state caratterizzate in termini di morfologia e struttura chimica. La biocompatibilità delle stesse è stata testata su hMSCs ed i risultati hanno confermato che le membrane elettrofilate sono biocompatibili e pertanto potenziali candidate per applicazioni con cellule staminali in medicina rigenerativa.