Ruolo del microbiota intestinale e dei suoi metaboliti nei meccanismi di fibrosi miocardica e fibrillazione atriale post-operatoria

Background. Atrial fibrillation (AFib) is a common arrhythmia in the general population, with an incidence of 1-2%. Atrial fibrosis has been shown to be one final common pathway of different risk factors and conditions. Microbiome and its metabolites, such as trimethylamine-N-oxide (TMAO), are known activators of inflammasomes and can induce fibrosis mainly through TGFb/SMAD pathways. Post-op AFib (POAF) is the most common disorder after cardiac surgery, with an incidence of 30-35% (30 times greater than "common" AFib), and is associated with detrimental short-term and long-term outcomes (higher risk of stroke, myocardial infarction and mortality). The high incidence of POAF compared to general AFib relies on specific surgical features, such as atrial manipulation / atriotomy / cannulation for cardiopulmonary bypass, pericardiectomy with increase of intrapericardial inflammatory cytokines (“sterile inflammation”), perioperative autonomic demodulation, inflammation and oxidative stress. Many factors have been shown to be involved in atrial remodeling and POAF. However, in the setting of postsurgical AFib, the role of microbiome in the modulation of cardiac fibrosis is still not investigated. This study aimed to analyze the effect of microbiome and its metabolites (TMAO) in the fibrosis of myocardial tissue evaluated in the right atrium, to investigate its role in the pathogenesis of POAF. Methods. Patients undergoing cardiac surgery with cardiopulmonary bypass and central atrio-caval cannulation, with preoperative sinus rhythm with no history of AFib, were included. Patients undergoing bicaval cannulation, urgent surgery, off-pump surgery and redo procedures were excluded. Sample size calculation estimated an enrollment of 100 patients. A fragment of right atrium was analyzed for qualitative evaluation (with routine staining, for fibrosis, angiogenesis and inflammation) and mRNA quantitative evaluation (with qRT-PCR, for collagen-1, collagen-3, fibronectin, TGFb and SMAD-2, with a normalized expression for reference gene GADPH). A blood sample was analyzed with ELISA assay for sP-selectin (marker of platelet activation), lypopolisaccardide [LPS] (marker of bacterial presence), zonulin (marker of gut permeability), TGFb (marker of fibrosis), and TMAO (microbiome metabolite). After the surgical procedure, patient rhythm was recorded as part of the clinical routine until hospital discharge. The primary endpoint of the study was to find predictive factors of postoperative AFib, trying to identify a relationship among atrial fibrosis, microbiome metabolites and postoperative arrhythmias. This study was monocentric, observational, no-profit. Study was approved by the Ethical Committee. Results. A total of 100 patients have been included, and POAF was observed in 38%. Baseline characteristics and intraoperative variables were similar between POAF and “no-POAF” (i.e. patients who remained in sinus rhythm) groups. Histologically, a higher degree of fibrosis, angiogenesis and inflammation has been observed in POAF (P=0.001). Quantitative evaluation showed increased mRNA expression of collagen-1 (POAF vs no-POAF: 2.47±0.29 vs 2.00±0.32, P=0.001), collagen-3 (1.48±0.35 vs 1.22±0.18, P=0.001), fibronectin (2.46±0.36 vs 1.92±0.63, P=0.001), TGFb (3.23±0.42 vs 2.88±0.46, P=0.001) and SMAD-2 (1.57±0.15 vs 1.44±0.25, P=0.030) in POAF group. ELISA analysis showed higher levels of TMAO (73.8 [58.6-86.7] vs 57.5 [45.2-71.1] ng/mL, P=0.001), LPS (49.7 [28.9-87.9] vs 14.7 [6.3-64.6], P=0.001) and TGFb (77.3 [66.2-94.1] vs 58.6 [49.6-68.5], P=0.001) in POAF, with similar levels of sP-selectin (P=0.189) and zonulin (P=0.218). Regression analysis showed that, after multivariate model adjustment and cut-off analysis, TMAO ≥ 61.8 ng/mL (OR 2.88 [1.35-6.16], P=0.006), preoperative anemia with Hb < 13.1 g/dL (OR 2.37 [1.07-5.24], P=0.033) and impaired right ventricular function with TAPSE < 20 mm (OR 2.38 [1.17-4.83], P=0.017) were independent predictors of POAF. Also, TMAO was significantly associated with POAF by means of increased fibrosis. Conclusions. Gut microbiome is crucial for myocardial fibrosis, which is a key factor for POAF. Patients in preoperative sinus rhythm who will develop POAF have increased genetic expression of collagen-1, collagen-3 and fibronectin, with enhanced fibrosis in histological staining. Cellular signaling through TGFb/SMAD pathway plays a pivotal role even in patients undergoing cardiac surgery. Bacterial presence (LPS) and TMAO values are higher in patients who will develop POAF, and higher TMAO levels (≥ 61.8 ng/mL) are a significant risk factor for POAF. In the future, modulation of microbiome or inhibition of detrimental downstream products might be a potential target against fibrosis of myocardial tissue and related arrhythmias, trying to dampen their negative effects.

Razionale. La fibrillazione atriale (FA) è una aritmia comune nella popolazione generale, con incidenza dell’1-2%. La fibrosi del tessuto atriale rappresenta la via finale comune di differenti fattori di rischio e condizioni. Il microbiota ed i suoi metaboliti, come la trimetilammina-N-ossido (TMAO), sono noti attivatori dell’inflammasoma e possono indurre fibrosi generalmente attraverso la via TGFb/SMAD. La fibrillazione atriale post-operatoria (POAF) è la aritmia più comune dopo interventi di cardiochirurgia, con una incidenza del 30-35% (30 volte maggiore rispetto alla FA non-cardiochirurgica) ed è associata ad outcomes negativi nel breve termine e nel lungo termine, per aumentato rischio di stroke, infarto miocardico e mortalità. L’alta incidenza di POAF rispetto alla FA non-cardiochirurgica dipende da alcune peculiarità chirurgiche, come la manipolazione atriale per la circolazione extracorporea, la pericardiectomia con aumento delle citochine pro-infiammatorie intra-pericardiche (c.d. “infiammazione sterile”), la disregolazione autonomica e lo stress ossidativo. Molti fattori sono noti per influenzare il remodeling atriale e la POAF, ma il ruolo del microbiota nella modulazione della fibrosi cardiaca non è stato valutato. Questo studio mira ad analizzare l’effetto del microbiota e dei suoi metaboliti (come il TMAO) nella fibrosi del tessuto miocardico (in atrio destro), per valutarne il ruolo nella POAF. Materiali e metodi. Sono stati inclusi pazienti sottoposti ad intervento cardiochirurgico in circolazione extracorporea con cannulazione atrio-cavale, in ritmo sinusale e senza anamnesi per FA. Sono stati esclusi i pazienti con cannulazione bicavale (es. chirurgia mitralica), i pazienti sottoposti ad intervento in urgenza o off-pump ed i pazienti candidati a re-intervento cardiochirurgico (redo). La stima della dimensione campionaria ha indicato di arruolare 100 pazienti. Un frammento di atrio destro è stato analizzato in maniera qualitativa (tramite colorazioni di routine, per grading di fibrosi, angiogenesi e infiammazione) e quantitativa dell’mRNA (tramite qRT-PCR, per collagen-1, collagen-3, fibronectin, TGFb e SMAD-2, normalizzando l’espressione per il gene di riferimento GADPH). Un campione ematico è stato analizzato in ELISA per sP-selectin (marker di attivazione piastrinica), lipopolisaccaride [LPS] (marker di presenza batterica), zonulina (marker di permeabilità intestinale), TGFb (marker di fibrosi) e TMAO (metabolita del microbiota). Dopo l’intervento chirurgico, il ritmo cardiaco del paziente è stato registrato fino alla dimissione come da pratica clinica. L’endpoint primario dello studio è l’identificazione di fattori predittivi di POAF, cercando di identificare una relazione tra fibrosi atriale, metaboliti del microbiota e aritmie postoperatorie. Questo studio, monocentrico, osservazionale e no-profit, è stato approvato del Comitato Etico. Risultati. Sono stati inclusi 100 pazienti, e la POAF ha avuto incidenza del 38%. Le variabili preoperatorie ed intraoperatorie erano simili nei pazienti che hanno sviluppato POAF e in quelli rimasti in ritmo sinusale (“no-POAF”). Istologicamente, un grado maggiore di fibrosi, angiogenesi ed infiammazione è stato osservato nei POAF (P=0.001). La valutazione quantitativa ha dimostrato una maggiore espressione di mRNA per geni pro-fibrotici nel gruppo POAF: collagen-1 (POAF vs no-POAF: 2.47±0.29 vs 2.00±0.32, P=0.001), collagen-3 (1.48±0.35 vs 1.22±0.18, P=0.001), fibronectin (2.46±0.36 vs 1.92±0.63, P=0.001), TGFb (3.23±0.42 vs 2.88±0.46, P=0.001) e SMAD-2 (1.57±0.15 vs 1.44±0.25, P=0.030). Le metodiche di ELISA hanno dimostrato livelli più elevati di TMAO (73.8 [58.6-86.7] vs 57.5 [45.2-71.1] ng/mL, P=0.001), LPS (49.7 [28.9-87.9] vs 14.7 [6.3-64.6], P=0.001) e TGFb (77.3 [66.2-94.1] vs 58.6 [49.6-68.5], P=0.001) nei POAF, con livelli simili di sP-selectin (P=0.189) e zonulin (P=0.218). In regressione multivariata, dopo adeguamento del modello e analisi di cutoff, TMAO ≥ 61.8 ng/mL (OR 2.88 [1.35-6.16], P=0.006), anemia preoperatoria con Hb < 13.1 g/dL (OR 2.37 [1.07-5.24], P=0.033) e ridotta funzione ventricolare destra con TAPSE < 20 mm (OR 2.38 [1.17-4.83], P=0.017) erano fattori predittivi indipendenti di POAF. Inoltre, TMAO è associato a POAF tramite un meccanismo fibrosi-dipendente. Conclusioni. Il microbiota intestinale è cruciale nei meccanismi che portano a fibrosi miocardica, che rappresenta un fattore essenziale per la POAF. I pazienti in ritmo sinusale che svilupperanno POAF hanno aumentata espressione genica di collagen-1, collagen-3 e fibronectin, con aumento della fibrosi a livello istologico. La via di signaling cellulare TGFb/SMAD ha un ruolo essenziale anche nei pazienti cardiochirurgici. La presenza batterica (LPS) ed il TMAO sono più elevati nei pazienti che svilupperanno POAF, e valori elevati di TMAO (≥ 61.8 ng/mL) sono un fattore di rischio significativo per POAF. Nel futuro, la modulazione del microbiota o l’inibizione delle vie del TMAO possono essere un target contro la fibrosi del tessuto miocardico e le aritmie correlate, permettendo di ridurre l’impatto negativo sui pazienti.