Analisi delle modificazioni del microambiente osseo indotte dai trattamenti di "ultima generazione" per il tumore della prostata metastatico

Numerous molecules are currently in various stages of clinical experimentation which, despite apparently targeting the tumor cell and not the bone microenvironment, have shown that an improvement in survival is also capable of modifying the natural history of bone metastases, determining a delay in the onset of SREs, a reduction in bone pain and an improvement in quality of life. This group of drugs includes abiraterone, a selective inhibitor of CYP17-alpha hydroxylase, capable of inhibiting the production of androgens at the level of the tumor cell itself and which, after treatment with docetaxel, has been shown to increase the survival of patients with cancer. of the prostate in the phase of resistance to castration, but also to reduce the incidence and delay the appearance of skeletal complications related to bone metastases, and, finally, to improve the "skeletal" quality of life. Among these there is also enzalutamide (MVD3100), a latest generation drug capable of binding the androgen receptor, preventing its transport to the nuclear level and its de-regulatory function on DNA which has been shown to increase survival and to delay the onset of skeletal events in the patient with metastatic prostatic neoplasia undergoing castration resistance after treatment with docetaxel. Finally, cabozantinib, an inhibitor of c-MET and of the VEGF pathway that has been shown to induce a high rate of objective responses at the level of bone metastases of patients with prostate cancer in the phase of castration resistance. In light of these recent evidences, the present thesis work aims to evaluate in vitro the direct effect of these three latest generation drugs, abiraterone, enzalutamide and cabozantinib in: - cellular models of androgen-dependent / independent prostate cancer in experimental conditions of presence / absence of androgens, evaluating the impact of treatment on important biological parameters such as cell proliferation and apoptosis; - primary cultures of human osteoclasts and osteoblasts in experimental conditions of presence / absence of androgens, evaluating a potential role of these drugs as direct modulators of metabolism and bone remodeling by means of functional osteoclastic / osteoblastic activity assays. Our results show both anabolic and osteoclastic inhibition activity of abiraterone accompanied by a modulation of osteoclastic and osteoblastic "marker genes". The hypothesis is that of an androgen-independent effect of abiraterone since its action is exerted both in the presence and absence of steroids. In fact, abiraterone induces a block of proliferation in an androgen-independent prostate cancer cell line, the PC-3, which does not express the androgen receptor. On the contrary, enzalutamide, administered at the same doses as abiraterone, does not appear to have any impact on osteoclastic and osteoblastic viability and maturation although it significantly regulates the expression levels of some osteoblastic "marker" genes. In particular, the treatment with enzalutamide down-regulates OPG and up-regulates RANKL, suggesting, in this case, an indirect osteoclast activation mediated by osteoblasts. The combination of the two agents on the bone microenvironment does not show any synergistic, additive or antagonistic effect, but an effect comparable to that obtained by treating osteoclasts and osteoblasts with abiraterone alone. Cabozantinib inhibits both differentiation and osteoclastic activity by downregulating some of the osteoclast "marker" genes such as TRAP and Cathepsin – K, but has no significant impact on osteoblastic differentiation and bone mineralization. Furthermore, treatment with cabozantinib significantly increases the expression of OPG and reduces that of RANKL, suggesting a mechanism of inhibition of osteoclastic activity not only direct but also indirect mediated by osteoblasts. Co-culture experiments of osteoclasts / osteoblasts confirmed this hypothesis by suggesting that cabozantinib intervenes in the regulation of the "cross-talk" between osteoblasts / osteoclasts by stimulating the osteoblasts to secrete cytokines which inhibit osteoclastic activation.

Attualmente sono in diverse fasi di sperimentazione clinica numerose molecole che, pur avendo apparentemente come target la cellula tumorale e non il microambiente osseo, hanno dimostrato oltre, che un miglioramento della sopravvivenza, di essere anche capaci di modificare la storia naturale delle metastasi ossee, determinando un ritardo della comparsa delle SRE, una riduzione del dolore osseo e un miglioramento della qualità di vita. In questo gruppo di farmaci rientra l'abiraterone, inibitore selettivo di CYP17-alpha idrossilasi, capace di inibire la produzione degli androgeni a livello della stessa cellula tumorale e che ha dimostrato, dopo trattamento con docetaxel, di aumentare la sopravvivenza dei pazienti affetti da tumore della prostata in fase di resistenza alla castrazione, ma anche di ridurre l'incidenza e ritardare la comparsa delle complicanze scheletriche correlate alle metastasi ossee, ed, infine, di migliorare la qualità di vita "scheletrica". Tra questi vi è anche l'enzalutamide (MVD3100), un farmaco di ultima generazione capace di legare il recettore per gli androgeni, di impedirne il trasporto a livello nucleare e la sua funzione de-regolatrice sul DNA che ha dimostrato di incrementare la sopravvivenza e di ritardare la comparsa di eventi scheletrici nel paziente affetto da neoplasia prostatica metastatica in fase di resistenza alla castrazione dopo trattamento con docetaxel. Infine il cabozantinib, un inibitore di c-MET e del pathway di VEGF che ha dimostrato indurre un elevato tasso di risposte obiettive a livello delle metastasi ossee di pazienti affetti da neoplasia prostatica in fase di resistenza alla castrazione. Alla luce di queste recenti evidenze, il presente lavoro di tesi ha l'obiettivo di valutare in vitro l'effetto diretto di questi tre farmaci, di ultima generazione, abiraterone, enzalutamide e cabozantinib in: - modelli cellulari di tumore alla prostata androgeno dipendente/indipendente in condizioni sperimentali di presenza/assenza di androgeni valutando l'impatto del trattamento su parametri biologici importanti come proliferazione e apoptosi cellulare; - colture primarie di osteoclasti ed osteoblasti umani in condizioni sperimentali di presenza/assenza di androgeni valutando un potenziale ruolo di questi farmaci come modulatori diretti del metabolismo e del rimodellamento osseo mediante saggi funzionali di attività osteoclastica/osteoblastica. I nostri risultati mostrano un'attività sia anabolica che di inibizione osteoclastica di abiraterone accompagnata da una modulazione dei "geni markers" osteoclastici ed osteoblastici. L'ipotesi è quella di un effetto androgeno-indipendente di abiraterone dal momento che la sua azione è esercitata sia in presenza che assenza di steroidi. Infatti l'abiraterone induce un blocco della proliferazione in una linea cellulare di carcinoma prostatico androgeno-indipendente, le PC-3, che non esprimono il recettore degli androgeni. Al contrario l'enzalutamide, somministrato alle stesse dosi dell'abiraterone, non sembra avere alcun impatto sulla vitalità e sulla maturazione osteoclastica ed osteoblastica sebbene regoli significativamente i livelli di espressione di alcuni geni "markers" osteoblastici. In particolare il trattamento con enzalutamide down-regola OPG e up-regola RANKL facendo ipotizzare, in questo caso, un'attivazione osteoclastica indiretta mediata dagli osteoblasti. La combinazione dei due agenti sul microambiente osseo non mostra alcun effetto sinergico, additivo o antagonista, ma un effetto paragonabile a quello ottenuto trattando gli osteoclasti e gli osteoblasti con il solo abiraterone. Il cabozantinib inibisce sia il differenziamento che l'attività osteoclastica down-regolando alcuni dei geni "markers" osteoclastici come TRAP e Catepsina–K, ma non ha un impatto significativo sul differenziamento osteoblastico e sul processo di mineralizzazione ossea. Inoltre il trattamento con cabozantinib incrementa significativamente l'espressione di OPG e ne riduce quella di RANKL facendo ipotizzare un meccanismo di inibizione dell'attività osteoclastica non solo diretto ma anche indiretto mediato dagli osteoblasti. Esperimenti di co-coltura di osteoclasti/osteoblasti hanno confermato questa ipotesi suggerendo che il cabozantinib interviene nella regolazione del "cross-talk" tra osteoblasti/osteoclasti stimolando gli osteoblasti a secernere citochine che vanno ad inibire l'attivazione osteoclastica.