Analisi proteomica quantitativa del fluido lacrimale per la diagnosi e la terapia farmacologica della Vernal Keratoconjunctivitis

Vernal keratoconjunctivitis (VKC) is a chronic allergic eye disease that leads to a severe inflammatory situation. The purpose of this study was to compare the qualitative and quantitative proteomic profile of normal subjects with that of patients suffering from VKC, in order to establish differences in their protein expression patterns. The samples were processed using iTRAQ technology, followed by analysis of samples by 1D-LC-MALDI-MS/MS During the first phase (biomarker discovery) have been realized five 4-plex iTRAQ experiments (using two control and two pathological samples in each experiment). The results obtained allowed the identification of three biomarkers of VKC: serum albumin, serotransferrin and hemopexin. 115/114 iTRAQ ratio (quantitative ratio of a given protein expressed in the two control samples) for these three proteins, indeed, is a number close to one in all the experiments; all pathological samples show a significant increase in the levels of these proteins; the overexpression of the three serum proteins, finally, has the same order of magnitude in the same subject. The analysis showed that the ten patients with VKC had an increase in the level of serum albumin proportional to the increase of the degree of severity of the disease (from mild to severe). The results, therefore, can give an objective measure of the severity of VKC. During the second phase of the study the effectiveness in the prevention and control of active phases of the disease of two drug treatments, cyclosporin A 1% and clobethason, was evaluated using 8-plex iTRAQ technology that allows simultaneous analysis of eight different subjects in the same experiment. The tears of all patients treated with cyclosporine A and clobetasone showed a significant decrease in the levels of serum albumin, serotransferrin and hemopexin with respect to those receiving no treatment, but also showed the decrease of two other typical serum proteins not detected in 4-plex experiments: apolipoprotein AI and alpha 1-acid glycoprotein. Results, therefore, were positive for both treatments and have confirmed the efficacy of these drugs for the management of active phases of the disease because they allow a good control of symptoms of VKC and in particular of the inflammatory situation.

La Vernal Keratoconjunctivitis (VKC) è una patologia oculare allergica cronica che determina nei soggetti che ne soffrono un quadro infiammatorio severo. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di analizzare il profilo proteomico qualitativo e quantitativo del fluido lacrimale appartenente a soggetti affetti da VKC e di confrontarlo con quello di soggetti sani, in modo da stabilire differenze presenti nel loro pattern di espressione proteico. I campioni sono stati trattati tramite la tecnologia iTRAQ, seguita dall analisi dei campioni tramite 1D-LC-MALDI MS/MS. Durante la prima fase (biomarker discovery) sono stati realizzati cinque esperimenti iTRAQ 4-plex (due campioni di controllo e due patologici in ogni esperimento). I risultati ottenuti hanno permesso di individuare tre biomarkers della VKC: siero albumina, serotransferrina ed emopexina. Il rapporto 115/114 (rapporto quantitativo di una data proteina espressa nei due campioni di controllo) per queste tre proteine, infatti, è un numero vicino ad uno in tutti gli esperimenti effettuati; tutti i soggetti patologici presentano un notevole aumento nei livelli di tali proteine; la sovraespressione delle tre proteine sieriche, infine, è dello stesso ordine di grandezza nello stesso soggetto. Le analisi sui dieci pazienti affetti da VKC hanno evidenziato un incremento lineare del livello di siero albumina analizzando soggetti che presentavano la patologia con un diverso grado di severità (da lieve a grave). I risultati ottenuti, pertanto, possono essere utilizzati anche per individuare in maniera obiettiva il grado di severità della patologia. Durante la seconda fase è stata impiegata la tecnologia iTRAQ 8-plex (analisi simultanea di otto diversi soggetti) per valutare l efficacia di due trattamenti farmacologici, uno a base di ciclosporina A all 1% e l altro sull impiego di clobetasone, nella prevenzione delle ricadute ed il controllo delle fasi attive della patologia. Le lacrime di tutti i soggetti trattati con ciclosporina A e con clobetasone rispetto ai soggetti non sottoposti ad alcun trattamento presentavano una notevole diminuzione nei livelli delle proteine siero albumina, serotransferrina, ed emopexina ma anche di altre due proteine tipicamente sieriche non individuate negli altri esperimenti: apolipoprotein A-I e alpha 1-acid glycoprotein. I risultati, dunque, sono stati positivi per entrambi i trattamenti ed hanno confermato l efficacia di tali farmaci per la gestione delle fasi attive della patologia in quanto consentono un buon controllo dei sintomi della VKC ed in particolare del quadro infiammatorio.