Calix[4]arene Derivatives as Artificial Phospodiesterases and Ligands for Proteins

The work of this PhD thesis was focused on the synthesis of novel calix[4]arene derivatives and on their studies as supramolecular catalysts and as ligands for proteins. The cone-calix[4]arene scaffold has been often described as an appropriate platform for the development of effective artificial phosphodiesterases, by decorating its upper rim with guanidinium groups or metal ion-containing ligating units. However, the possibility to exploit the cooperation between these two different types of catalytically active units in the cleavage of phosphodiester bonds, when present on the same macrocyclic scaffold, was not evaluated before this thesis work. Thus, we synthesized two new cone-calix[4]arene derivatives, bearing at the upper rim a guanidinium group and a triazacyclononane moiety in 1,3 distal- or 1,2 vicinal- position, as ligating unit for Zn(II) or Cu(II) ions. After the synthesis, the purification and the characterization of these compounds, detailed kinetic studies were performed to investigate the catalytic activity of the corresponding metal complexes. The Cu(II)-complexes of both the distal and vicinal catalysts gave rise to a high acceleration in the cleavage of 2-hydroxypropyl-p-nitrophenylphosphate (HPNP) and bis-p-nitrophenylphopshate (BNPP), which can be considered as activated RNA and DNA model compounds, respectively. The rate enhancements of the studied processes were of 5-6 orders of magnitude respect to the background reaction. The same Cu(II)-based catalysts were also tested in the cleavage of different diribonucleoside monophosphates, showing a noteworthy phosphodiesterase activity, with acceleration of the reaction, in the best case, as high as 107-folds compared to the background. The combination of the data collected from the kinetic and potentiometric investigations suggested that the studied artificial catalysts exploited a general-base action or a nucleophilic attack of a metal-bound hydroxide ion to allow hydrolysis to occur. Quite relevant appeared to be the electrostatic stabilization of the transition state provided by electrostatic interactions involving the guanidinium unit and the phosphate groups of the reacting partners. In order to mimic the catalytic triad present in the active site of the human Topoisomerase I enzyme, composed by a tyrosine and two arginine units, we also synthesized a third calix[4]arene-based phosphodiesterase model, by functionalizing its upper rim with a phenolic hydroxyl group and two proximal guanidinium units. The bis-protonated form of this compound was tested in the cleavage of the DNA model compound BNPP (bis-p-nitrophenyl phosphate) and was found to promote the p-nitrophenol liberation from the substrate with a rate enhancement of 6.5∙104-folds compared to the background hydrolysis. The experimental data indicated that the three active units of this compound cooperate in a reaction sequence involving a phosphoryl transfer process from BNPP to the nucleophilic phenolate moiety of the calix[4]arene-derivative, followed by a further liberation of p-nitrophenolate from the phosphorylated intermediate, which takes place thanks to the electrophilic activation by the neighboring guanidine/guanidinium dyad. At the end of the process, the resulting phosphorylated calix[4]arene was rather inert toward dephosphorylation and, consequently, had no turnover. Thus, the starting bisguanidinium-phenolic derivative should be more properly described as a promoter rather than as a catalyst. The calix[4]arene scaffold can also be effectively used for the creation of ligands able to recognize the surface of different proteins and to influence their physico-chemical properties or biological activity. Accordingly, some calix[4]arene derivatives were tested as ligands for different model proteins, during a five months-placement period spent in Galway at the National University of Ireland, under the supervision of Dr. Peter Crowley. The first investigated protein-ligand couple was composed by cytochrome c (cyt c) and a calix[4]arene derivative bearing at its upper rim four C-terminal alanine residues, which were considered as appropriate binding units for the protein surfaces, mainly positively charged at neutral pH. 15N-HSCQC NMR titrations pointed out that the ligand was able to recognize different lysine side chains on the protein surfaces (i.e. Lys4 and one of the two neighboring Lys87 and Lys 89), in agreement with what reported for other negatively charged calix[4]arene derivatives. The fitting of the chemical shift perturbations (CSP) experienced by the amide resonances upon increasing the ligand concentration, allowed to demonstrate the presence of at least two binding sites on the protein surfaces, with values for the corresponding dissociation constants (Kd) of 0.4 mM and 1.2 mM. Attempts to get more detailed thermodynamic and structural information for this binding event by ITC or co-crystallization experiments were unsuccessful, since, in the tested experimental conditions, the calorimetric investigations yielded negligible heat of reaction, while in the co-crystallization studies only jellification of the protein was observed in the presence of the ligand. A second protein-ligand system studied was formed by the immunoglobulin binding domain B1 of streptococcal protein G (GB 1) and a small library of different tetraguanidinium calix[4]arenes. The corresponding binding events were investigated by ITC experiments, with the aim to get additional data to support those obtained by NMR titrations in a previous work. In the tested conditions, feasible data were acquired only when a solution of GB 1 was injected in a solution of a calix[4]arene functionalized with four 3-guanidiniumpropoxy- moieties at the lower rim. The Kd determined by ITC (8.9 M) as fitting parameter of the resulting binding isotherm, was slightly lower than that previously estimated by NMR (80 M), while the stoichiometry of binding (n= 0.85) suggested the coexistence of 1:1 and 1:2 protein to ligand complexes in solution. The analysis of the different contributions to the overall binding free energy pointed out that both the enthalpy and the entropy terms were favorable for the recognition event and similar in magnitude, thus indicating that both electrostatic and hydrophobic interactions are important to allow the binding process to take place. Taking into account also the results of the NMR titrations, it was proposed that the electrostatic interactions could involve the guanidinium pendant groups at the lower rim of the macrocycle and negatively charged amino acid residues (i. e. Asp36, Glu15 and Glu42) on the protein surfaces, while hydrophobic, C-H/π or cation/π interactions could take place between the calix[4]arene backbone and aromatic/neutral amino acid residues (i. e. Thr18, Phe30, Gly14) or positively charged amino acid side (i. e Lys13).

Questo lavoro di tesi è stato incentrato sulla sintesi di nuovi derivati calix[4]arenici e sullo studio del loro utilizzo come catalizzatori supramolecolari e come leganti per proteine. Lo scaffold calix[4]arenico, in conformazione a cono, è stato spesso descritto come una piattaforma adatta allo sviluppo di efficienti fosfodiesterasi artificiali, in seguito alla funzionalizzazione del suo bordo superiore con gruppi guanidinio o unità leganti contenenti ioni metallici. Tuttavia, la possibilità di sfruttare la cooperazione tra diversi tipi di unità catalitiche presenti sullo stesso scaffold macrociclico per il cleavage di legami fosfodiesterei non era stata valutata prima di questo lavoro di tesi. Sono stati quindi sintetizzati due nuovi derivati calix[4]arenici, funzionalizzati al bordo superiore in posizione 1,3 distale o 1,2-vicinale con un gruppo guanidinio e una unità di triazaciclononano come legante per ioni Zn(II) o Cu(II). Dopo la sintesi la purificazione e la caratterizzazione di questi composti, sono stati eseguiti dettagliati studi cinetici dell’attività catalitica dei complessi metallici corrispondenti. I complessi di Cu(II) di entrambi i catalizzatori hanno dato origine a consistenti accelerazioni della scissione del 2-idrossipropil-p-nitrofenilfosfato (HPNP) e del bis-p-nitrofenilfosfato (BNPP), che possono essere considerati rispettivamente composti modello dell’RNA e del DNA, registrando aumenti della velocità del processo in oggetto di 5-6 ordini di grandezza rispetto alla reazione di background. Gli stessi catalizzatori contenenti Cu(II) sono stati testati anche nella scissione di alcuni diribonucleosidi monofosfato, mostrando una notevole attività come fosfodiestasi, con accelerazioni delle velocità di reazione fino a 107-volte rispetto al background. La combinazione dei dati raccolti dalle indagini cinetiche e potenziometriche suggerisce un meccanismo di reazione in cui i catalizzatori in oggetto sfruttino l’azione come base generica o di attacco nucleofilo da parte di uno ione idrossido legato al centro metallico. Determinante sembra anche la stabilizzazione fornita dalle interazioni elettrostatiche tra l’unità di guanidinio e le cariche negative del fosforano presente nello stato di transizione. Con l’obiettivo di mimare la triade catalitica presente nel sito attivo dell’enzima umano Topoisomerasi I, costituita da un residuo di tirosina e da due di arginina, è stato sintetizzato anche un terzo modello di fosfodiesterasi basato su calix[4]areni, tramite funzionalizzazione del bordo superiore con un idrossile fenolico e due unità di guanidinio adiacenti. La forma bis-protonata di questo composto è stata testata nella scissione di un composto modello del DNA, il BNPP (bis-p-nitrofenilfosfato), promuovendo il rilascio di p-nitrofenolo dal substrato 6.5∙104-volte più velocemente rispetto al processo idrolitico di background. I dati sperimentali indicavano che le tre unità catalitiche cooperano in una sequenza di reazioni che comprende un trasferimento di fosforile dal BNPP al fenolato nucleofilo del derivato calix[4]arenico, seguito da un ulteriore rilascio di p-nitrofenolo dell’intermedio fosforilato, che avviene grazie all’attivazione elettrofila da parte della coppia guanidina/guanidinio adiacente. Alla fine del processo, il calix[4]arene fosforilato che ne risultava appare inerte verso la defosforilazione e non presenta turnover. Il derivato trifunzionale bisguanidinio-fenolo di partenza dovrebbe essere di conseguenza descritto come un promotore piuttosto che come un catalizzatore. Lo scaffold calix[4]arenico può essere anche utilizzato per creare leganti in grado di riconoscere la superficie di proteine e di influenzarne le proprietà fisico-chimiche o l’attività biologica. Con questi intenti, alcuni derivati calix[4]arenici sono stati testati come leganti per diverse proteine modello durante un periodo di cinque mesi passato alla National University of Ireland di Galway, sotto la supervisione del Dr. Peter Crowley. La prima coppia proteina legante ad essere stata studiata era composta dal citocromo c (cyt c) e un calix[4]arene che portava al bordo superiore quattro residui di alanina C-terminali. Questi residui, carichi negativamente, si presupponeva potessero fungere da unità leganti adatte alle superficie della proteina, carica positivamente a pH neutro. Titolazioni 15N-HSCQC NMR hanno evidenziato che il legante è in grado di riconoscere diverse catene laterali di lisina sulle superfici proteiche (ovvero la Lys4 e una tra le due Lys87 e Lys89 prossimali), in accordo con quanto riportato per altri calix[4]areni carichi negativamente. Il fitting delle perturbazioni di chemical shift (CSP) delle risonanze ammidiche all’aumentare della concentrazione di legante hanno permesso di dimostrare la presenza di almeno due siti di legame sulle superfici proteiche, con valori per le corrispondenti costanti di dissociazione (Kd) pari a of 0.4 mM e 1.2 mM, rispettivamente, per i due siti di legame. Tentativi di ottenere informazioni termodinamiche e strutturali più dettagliate su questo fenomeno di riconoscimento attraverso esperimenti ITC o di co-cristallizzazione non hanno avuto successo, dato che dalle indagini calorimetriche sono stati ricavati calori di reazione trascurabili, mentre negli studi di co-cristallizzazione è stata osservata solo la gelificazione della proteina in presenza del legante. Un secondo sistema studiato è stato quello del dominio di legame B1 della proteina G streptococcica (GB 1) con una piccola libreria di diversi tetraguanidino calix[4]areni. L’interazione proteina-ligando è stata studiata con esperimenti ITC, con l’obiettivo di estrarre dati aggiuntivi per supportare quelli ottenuti con titolazioni NMR in un lavoro precedente. Nelle condizioni testate, sono stati ottenuti dati trattabili solo iniettando una soluzione di GB 1 in una soluzione contenente un calix[4]arene funzionalizzato al bordo inferiore con quattro gruppi 3-guanidiniopropossido. La Kd, determinata via ITC (8.9 M) come parametro di fitting della isoterma, è risultata leggermente inferiore a quella stimata in precedenza via NMR (80 M), mentre la stechiometria di legame (n= 0.85) suggeriva la coesistenza in soluzione di complessi proteina-legante 1:1 e 1:2. L’analisi dei differenti contributi all’energia libera di legame totale ha evidenziato che il termine entropico e quello entalpico sono entrambi favorevoli per l’evento di riconoscimento studiato e di entità simile, indicando quindi che interazioni sia elettrostatiche che idrofobiche sono importanti perché il processo di legame possa avvenire. Prendendo in considerazione anche i risultati delle titolazioni NMR, è stato quindi proposto che le interazioni elettrostatiche coinvolgano i pendagli guanidinici al bordo inferiore del macrociclo e i residui amminoacidici carichi negativamente (per esempio Asp36, Glu15 and Glu42) sulle superfici proteiche, mentre interazioni idrofobiche, C-H/π o catione/π possano aver luogo tra il backbone del calix[4]arene e i residui amminoacidici aromatici/neutri (Thr18, Phe30, Gly14) o catene laterali cariche positivamente (Lys13).