Inhalable lipid microparticle and spray dried formulations based on polyphenolic compounds

L’infiammazione acuta e cronica di alveoli e/o bronchi sta alla base della patogenesi e dello sviluppo di malattie infiammatorie croniche polmonari come asma e broncopneumopatia cronico ostruttiva (BPCO) [1]. L’asma è una malattia infiammatoria caratterizzata da un’ostruzione generalmente reversibile, ma a volte irreversibile, delle vie aeree inferiori, caratterizzata da una sintomatologia variabile e ricorrente, come ostruzione delle vie aeree e broncospasmo [2]. La BPCO è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo [3, 4], ed è caratterizzata da infiammazione cronica, dalla limitazione del flusso aereo, da ipersecrezione di muco, enfisema e broncocostrizione che portano ad una diminuzione dell’attività respiratoria fino alla morte. La terapia farmacologica per il trattamento di queste patologie ha diversi target farmacologici, diversi tipi di farmaci e vie di somministrazione. Ad oggi, non esiste una terapia in grado di ripristinare le normali funzioni polmonari, poiché tutti i trattamenti farmacologici mirano a rallentare la progressione di queste malattie e a ridurne i sintomi [5]. L’infiammazione e lo stress ossidativo stanno alla base della patogenesi di queste malattie [6]. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato come lo stress ossidativo svolga un ruolo importante nella patogenesi di malattie polmonari in quanto causa un’ infiammazione irreversibile delle vie aeree attraverso il rilascio di mediatori dell’infiammazione. Di conseguenza, l'identificazione di composti ad attività antiossidante e anti-infiammatoria, quali i polifenoli (quercetina e resveratrolo), può essere una via terapeutica vantaggiosa in quanto queste molecole riescono a modulare vari aspetti biochimici delle malattie infiammatorie croniche polmonari. I polifenoli, presentano numerose attività benefiche, ma ad oggi il loro utilizzo risulta essere limitato dalla loro bassa biodisponibilità a causa della loro scarsa solubilità in acqua, rapida metabolizzazione e instabilità chimica [7]. Per questi motivi, la mia attività di ricerca si è focalizzata sullo sviluppo di sistemi microparticellari da somministrare per via inalatoria al fine di avere una consegna sito-specifica a livello polmonare, migliorando così la biodisponibilità dei polifenoli studiati. Il lavoro sperimentale è stato diviso in tre sezioni: I. SEZIONE A: Inhalable dry powder based on quercetin-loaded lipid microparticles for pulmonary delivery; II. SEZIONE B: Inhalable resveratrol spray dried formulation to improve the treatment of chronic inflammatory lung diseases; III. SEZIONE C: In vitro activities of co-spray dried resveratrol and budesonide inhalable formulations in alveolar macrophages. I. SEZIONE A La quercetina, è una molecola appartenente ai polifenoli, che grazie alla sua attività anti-ossidante e anti-infiammatoria presenta diverse attività farmacologiche rispetto a diverse malattie. Specificamente per le malattie polmonari, studi in vitro e in vivo dimostrano come questo flavonoide presenta delle proprietà favorevoli per il trattamento dell’asma [8, 9]. Nonostante le sue attività siano favorevoli rispetto a diverse patologie, il suo utilizzo risulta essere limitato dal rapido metabolismo, scarsa permeazione cellulare e dalla sua instabilità nei fluidi biologici [8, 10, 11]. Per questo motivo, in diversi studi è riportata l’incapsulazione della quercetina in sistemi micro- e nanoparticelle [9, 12]. Le microparticelle lipidiche (LM) rappresentano un ottimo sistema di per veicolare la quercetina direttamente a livello polmonare, avendo così un aumento della sua concentrazione nel sito di azione [13]. In questo studio la quercetina è stata incapsulata all’interno delle ML, ottenendo così una formulazione di polvere secca da somministrare per via inalatoria. Le ML ottenute sono state caratterizzate sia da un punto di vista morfologico che come caratteristiche chimico-fisiche, ed inoltre è stata valutata l’efficienza di incapsulazione del flavonoide nella matrice lipidica. Con lo scopo di valutare l’effetto delle ML sull’attività in vitro della quercetina sono stati condotti studi in vitro utilizzando linee cellulari epiteliali alveolari A549 per valutare la permeazione del flavonoide. Le ML sono state ottenute mediante la tecnica della fusione-emulsione ed i componenti che hanno permesso di ottenere le condizioni migliori sono state la tristearina come lipide e fosfatidilcolina come tensioattivo. Il contenuto di quercetina nelle ML e l’efficienza di incapsulazione sono stati di 11.8 ± 0.3% (p/p) e 72,4 % rispettivamente. Informazioni riguardo morfologia e dimensioni delle ML sono state ottenute da osservazioni al microscopio ottico e con la microscopia a scansione elettronica (SEM), le cui immagini hanno mostrato morfologia sferica delle ML con dimensioni adatte alla somministrazione a livello polmonare. Dagli studi di rilascio si evince che la quercetina è stata incapsulata all’interno della matrice lipidica in quanto la cinetica di rilascio della quercetina incapsulata è inferiore rispetto alla velocità di dissoluzione della quercetina libera. Per valutare l’effetto delle microparticelle su linee cellulari sono state utilizzate le cellule epiteliali alveolari A549. I risultati ottenuti mostrano che dopo 4h di incubazione il quantitativo di quercetina nelle cellule A549 è stato significativamente maggiore rispetto al flavonoide non incapsulato. L’ aumento del quantitativo di quercetina permeata è dovuto al fatto che le ML impediscono la metabolizzazione del flavonoide e che quindi modulandone il rilascio nel tempo ne permettono l’assorbimento a livello cellulare. In conclusione, i risultati ottenuti mostrano come le ML rappresentano un buon sistema di veicolazione della quercetina a livello polmonare come nuovo approccio terapeutico per il trattamento di malattie infiammatorie delle vie aeree. II: SECTION B: Il resveratrolo, è un composto polifenolico di origine naturale che viene prodotto da diverse specie di piante e che presenta diverse attività benefiche, tra cui le attività anti-infiammatoria e antiossidante [14, 15]. La formulazione del resveratrolo come polvere secca rappresenta una buona via per veicolarlo a livello polmonare, in quanto l’utilizzo di questo polifenolo in soluzione non è possibile data la sua instabilità, la sua rapida degradazione per ossidazione e la sua scarsa solubilità in acqua [16]. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di formulare il resveratrolo in una formulazione di polvere secca da somministrare per via inalatoria per il trattamento della BPCO utilizzando la tecnica dello spray drying. Nello specifico è stata valutata l’efficacia del resveratrolo come inalabile polvere secca (spray dried resveratrolo) e la sua attività anti-infiammatoria e anti-ossidante nelle linee cellulari bronchiali Calu-3. Sono state valutate le caratteristiche morfologiche e chimico fisiche della formulazione. L’ efficienza di aerosolizzazione è stata determinata utilizzando l’Andersen Cascade Impactor (ACI). Successivamente sono stati valutati la deposizione, il trasporto e l’uptake cellulare dello spray dried resveratrolo utilizzando le linee cellulari Calu-3 inserite in un ACI modificato. Infine è stata valutata l’attività anti-ossidante e anti-infiammatoria del resveratrolo nelle cellule Calu-3. I risultati ottenuti mostrano come le particelle ottenute con lo spray drying hanno morfologia sferica e diametro inferiore a 5 μm. La frazione di particelle fini (FPF) e il diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) della formulazione spray dried sono stati di 39.9 ± 1.1% e 3.7 ± 0.1 μm, rispettivamente, utilizzando l’ACI a 60 l/min. Gli studi in vitro indicano che il resveratrolo non causa effetti tossici significativi nelle cellule Calu-3 anche ad alte concentrazioni (fino a 160 μM). Dagli studi di trasporto si è visto come l’80% del resveratrolo è in grado di permeare le Calu-3 dopo 4h dalla deposizione della polvere sulle cellule. Lo spray dried resveratrolo presenta attività antiinfiammatoria nei confronti delle cellule Calu-3 in quanto l’espressione di interleuchina-8 (IL-8) è stata significativamente ridotta dopo aver favorito l’infiammazione cellulare con il fattore di necrosi tumorale alpha (TNF-α), fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1) e il lipopolisaccaride (LPS). Infine lo spray dried resveratrolo ha mostrato di possedere attività anti-ossidante sulle cellule Calu-3. Questi dati mostrano come il resveratrolo presenti delle attività terapeutiche per le malattie polmonari, come asma e BPCO e che la formulazione spray dried rappresenta un ottimo sistema per veicolare il resveratrolo direttamente a livello polmonare. In conclusione , i risultati dimostrano come il resveratrolo può essere formulato come polvere secca da somministrare per via inalatoria nel trattamento di malattie infiammatorie croniche polmonari, come la BPCO. III.SECTION C: Il trattamento farmacologico per la BPCO è sintomatico e include l’utilizzo farmaci corticosteroidi da somministrare per via inalatoria (es. budesonide). I corticosteroidi sono molecole che sono in grado di diminuire il rilascio di mediatori dell’infiammazione a livello dei macrofagi alveolari, ma questa loro attività diminuisce in pazienti con BPCO in quanto viene inibita l’attività dell’istone deacetilasi (HDAC2) [17]. C’è il bisogno di un nuovo approccio terapeutico per la BPCO in quanto vi è un aumento della resistenza ai corticosteroidi nei pazienti con BPCO ed inoltre perché il trattamento farmacologico non è in grado di bloccare questa patologia [18]. L’infiammazione sistemica e lo stress ossidativo sono gli elementi centrali che stanno alla base della BPCO ed inoltre sono i bersagli terapeutici [19]. La combinazione di una composto ad attività anti-ossidante con uno ad attività antiinfiammatoria può essere investigato come nuovo approccio terapeutico per la BPCO. Questo studio ha avuto come scopo quello di preparare e caratterizzare una inalabile formulazione, co-spray dried contenente resveratrolo e budesonide. Sono state prodotte diverse formulazioni che sono state caratterizzate da un punto di vista chimico-fisico e ne sono state valutate le proprietà aerosolizzanti. L’attività biologica è stata studiata utilizzando linee cellulari di macrofagi alveolari, nello specifico è stata valutata la citotossicità, l’attività anti-infiammatoria e anti-ossidante delle diverse formulazioni preparate. Tutte le co-spray dried formulazioni contenenti resveratrolo e budesonide hanno mostrato morfologia e dimensioni appropriate per la somministrazione polmonare. L’analisi dei dati di efficienza di aerosolizzazione hanno mostrato un aumento di capacità di proprietà aerosolizzanti proporzionale alla concentrazione della budesonide. I macrofagi alveolari hanno mostrato di tollerare resveratrolo e budesonide nel range di concentrazioni investigato. Inoltre, resveratrolo e budesonide, presentano attività anti-infiammatoria nei macrofagi dopo aver indotto l’infiammazione con LPS perché in grado di diminuire e livelli di TNF-α e interleuchina-6. La capacità anti ossidante delle formulazioni è stata misurata come la loro capacità di ridurre il quantitativo di ossido nitrico nei macrofagi alveolari stimolati con LPS. I risultati ottenuti mostrano un’attività anti-ossidante che è concentrazione dipendente per i singoli composti, ma la riduzione è stata maggiore quando resveratrolo e budesonide sono stati utilizzati in combinazione. In conclusione, in questo studio sono state prodotte delle formulazioni co-spray dried di resveratrolo e budesonide che presentano morfologia e proprietà aerosolizzanti appropriate per la loro somministrazione per via inalatoria. Queste formulazione non hanno effetti tossici significativi nei macrofagi alveolari ed inoltre presentano attività anti-infiammatoria e anti-ossidante dopo aver indotto l’infiammazione cellulare con LPS.