Studio di nuovi meccanismi molecolari responsabili della nefroprotezione del Resveratrolo in vivo e in vitro

RIASSUNTO Introduzione L'ischemia renale è l'evento patogenetico più frequentemente coinvolto nell'insufficienza renale acuta sia in reni nativi che trapiantati, in quanto sono molteplici le situazioni cliniche che possono ridurre il flusso ematico renale. La severità del danno dipende dalla durata dell’ischemia, anche se, paradossalmente, è la riperfusione ad essere associata al maggior danno tessutale. Difatti dopo l’ischemia le cellule sono impoverite di energia, ma non si formano radicali tossici perché nei tessuti non c’è ossigeno; viceversa al ripristino della circolazione nel tessuto anossico, vengono generate enormi quantità di radicali tossici. Quando ciò si verifica, i meccanismi di neutralizzazione sono in breve tempo esauriti, per cui la cellula va incontro a danno grave e morte cellulare. Oltre a quanto descritto, è ormai accettato che il danno ossidativo è associato all’attivazione/inibizione di specifiche vie di signaling molecolare e all’espressione od attività di enzimi coinvolti nella regolazione genica come la SIRT-1. E’ a questi eventi che si deve la modulazione del processo infiammatorio, con produzione di citochine, aumento dell’espressione di molecole di adesione e rilascio di chemochine per il reclutamento dei polimorfonucleati circolanti nella sede di riperfusione. Protocollo Sperimentale Lo scopo di questo lavoro sperimentale è stato quello di indagare alcuni dei meccanismi molecolari che fanno del Resveratrolo una molecola con molteplici campi di applicazione farmacologica. La sperimentazione in vitro si è concentrata sulla valutazione dell’espressione di SIRT-1 e sullo studio della modulazione di alcuni segnali molecolari rapidi (ERK ½, AMPK, AKT) e del fattore di trascrizione HIF2α da parte del Resveratrolo, utilizzando la tecnica del Western Blot. Inoltre è stata osservata la risposta allo stimolo di tipo ossidativo indotto dal perossido di idrogeno dopo incubazione con il Resveratrolo, valutata con test del trypan blue, test colorimetrici (XTT) e test fluorimetrici (CytoTox Fluor). Infine sono stati utilizzati specifici inibitori per i due principali segnali da noi investigati, ERK 1/2 e AMPK, al fine di fare luce sul loro reale coinvolgimento nella modulazione dell’espressione di SIRT1. Per la sperimentazione in vitro è stata utilizzata una linea cellulare immortalizzata di tubulo prossimale umane (HK-2) mantenuta in RPMI 1640 con soluzione di Streptomicina-Penicellina (1:100) e FBS 10% in condizioni standard (37°C con CO2 al 5% e umidità al 95%). Gli esperimenti sono stati condotti nella fase di crescita log e le cellule sono state piastrate in piastre multi pozzetto 24h prima di qualsiasi trattamento e tenute in mezzo di coltura con FCS 3% qualche ora prima di procedere con il protocollo sperimentale. La sperimentazione in vivo è stata condotta in più fasi sperimentali utilizzando un modello animale di Ischemia-Riperfusione (I/R) renale: in un primo momento è stato studiato l’azione nefroprotettiva del resveratrolo somministrato immediatamente prima (1h prima) dell’evento ischemico (40’) a tempi diversi di riperfusione; è stata indagata e discussa la capacità del RSV non solo di proteggere il rene (valutazione morfologico-funzionale), ma anche di modulare gli stessi segnali molecolari attivati durante l’Ischemia e Riperfusione renale. Per una più completa comprensione dei segnali molecolari associati alla somministrazione di RSV, gli animali iniettati col polifenolo sono stati sacrificati a tempistiche diverse. Infine è stato allestito un ultimo protocollo sperimentale per valutare gli effetti di una somministrazione subacuta di Resveratrolo (15 giorni) sull’espressione tissutale di SIRT-1 dopodiché è stata valutata la variazione di tale proteina e l’azione protettiva della somministrazione prolungata via i.p. del resveratrolo nei confronti del danno da I/R renale. Conclusioni I dati dello studio sperimentale in vivo ed in vitro dimostrano che modeste concentrazioni di RSV sono in grado di aumentare l’espressione basale di SIRT-1 nel tessuto renale in seguito dell’attivazione di specifici segnali molecolari, primo tra tutti AMPK. Pertanto, anche se il RSV a concentrazioni micro molari ha una ben documentata azione anti-infiammatoria ed anti-ossidante, l’utilizzo di concentrazioni nano molari di questo polifenolo, grazie alla regolazione di alcune cascate di attivazione molecolare, può determinare un aumento dell’espressione basale di SIRT-1; tale aumento correla con la protezione nei confronti del danno da I|R. I dati emersi costituiscono un substrato scientifico per ulteriori indagini riguardanti il possibile utilizzo farmacologico dei polifenoli nel trattamento o nella prevenzione di patologie acute e croniche del tessuto renale.