Effetti modulatori di estratti secchi delle tre specie medicinali di Echinacea sui processi differenziativi e maturativi delle cellule dendritiche in presenza o assenza di microambiente tumorale pancreatico

Introduzione. L’Echinacea è una pianta erbacea perenne originaria del Nord America, ma da molto tempo coltivata anche in Europa. Esistono dieci specie appartenenti al genere, di cui solo tre presentano proprietà medicinali: Echinacea angustifolia, Echinacea pallida, Echinacea purpurea. Ad oggi formulazioni costituite da estratti di Echinacea sono impiegate comunemente in virtù della loro attività immunostimolante, antinfiammatoria, antivirale e antiossidante, anche se il meccanismo d’azione dei principi attivi di tali componenti non è stato ancora sufficientemente investigato. Questo studio si propone di approfondire il meccanismo di azione tramite cui i fitoestratti di Echinacea svolgono l’attività immunostimolante; in particolare, viene indagato l’effetto di tali composti sulla generazione, maturazione e attività funzionale delle cellule dendritiche (DC). Le DC rappresentano le più importanti cellule presentanti l’antigene: esse controllano sia l’inizio e il mantenimento delle risposte immuni adattative, che l’induzione di tolleranza. Materiali e Metodi. Le DC sono generate in vitro a partire da monociti CD14+ circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da buffy coat di donatori sani mediante separazione immunomagnetica. I monociti CD14+ così ottenuti sono coltivati in terreno RPMI 1640 addizionato di siero fetale bovino, L-glutammina, streptomicina e penicillina e supplementato con fattori di crescita (GM-CSF e IL-4), in presenza o assenza di estratto di radice (estratto totale, frazione idrofila o frazione lipofila) delle tre specie di Echinacea a concentrazioni comprese tra 100 e 200 µg/mL. Al 6° giorno di coltura le cellule ottenute sono indotte a maturare mediante aggiunta di LPS per ulteriori 24 ore; le cellule dendritiche immature o mature sono sottoposte ad analisi morfologica (tramite allestimento di citocentrifugati e colorazione May-Grunwald Giemsa) e fenotipica (mediante citofluorimetria a flusso). I marcatori utilizzati sono l’antigene CD14, espresso dai monociti e perso durante il processo di generazione delle DC, le molecole costimolatorie CD40 e CD80, l’antigene HLA di classe II (HLA-DR) e l’antigene CD83 espresso dalle DC mature. L’analisi citofluorimetrica di tali antigeni è effettuata anche su cellule dendritiche generate in cocoltura con cellule della linea tumorale pancreatica Capan-1, in presenza o assenza di Echinacea. Gli studi funzionali delle DC, in presenza degli estratti delle tre specie di Echinacea, comprendono l’analisi citofluorimetrica dell’attività endocitotica mediata dal recettore per il mannosio, utilizzando come antigene il destrano FITC-coniugato, ed il dosaggio con metodo immunoenzimatico delle citochine (IL-6, IL-1, IL-10, IL-12, TGF-β, TNF-α) rilasciate nei surnatanti delle colture di DC. È valutata, inoltre, la presenza della P-glicoproteina sulla membrana cellulare delle cellule dendritiche, in presenza o assenza degli estratti totali di Echinacea, sia mediante saggio di efflusso della rodamina 123, che mediante reazione a catena della polimerasi (RT-PCR). Risultati e Discussione. I fitoestratti non compromettono la generazione delle DC a partire dai monociti (perdita di espressione dell’antigene CD14). Gli estratti totali di Echinacea, tuttavia, ostacolano la maturazione delle DC stesse, come mostrato dalla ridotta espressione dell’antigene CD83 rispetto ai controlli. Si osserva, inoltre, una ridotta espressione (sia come percentuale che come intensità media di fluorescenza) delle molecole di superficie CD80 e HLA-DR, rispetto al controllo; per quanto riguarda l’antigene CD40 si riscontra una riduzione di espressione della sola intensità media di fluorescenza. Non sono riscontrate differenze significative relative al fenotipo cellulare, né sulla base della concentrazione utilizzata, né sulla base della specie di provenienza degli estratti. Da risultati preliminari, invece, si evince che il trattamento con le frazioni lipofile e idrofile non determina un blocco della maturazione delle DC così marcato, come quello effettuato dal trattamento con gli estratti totali. In seguito ad aggiunta dello stimolo maturativo si riscontra, infatti, l’espressione dei marker CD40, CD80 e CD83, in taluni casi maggiore rispetto a quella rilevata sulle DC non trattate. Nel microambiente tumorale, è osservata una difficoltà nella generazione delle DC, visualizzata come aumento dell’espressione del CD14 al 6° giorno di coltura. Il trattamento con E. purpurea alle concentrazioni di 100, 150 e 200 μg/mL permette di ripristinare nella cocoltura i valori relativi al CD14 paragonabili a quelli del controllo. Esso, inoltre, provocava un aumento della percentuale e dell’intensità di espressione del CD40 (pur non raggiungendo i valori del controllo) e, solo in minima parte, del CD80, antigeni la cui intensità era ridotta dal microambiente tumorale. Per quanto riguarda la P-glicoproteina, attraverso il saggio di efflusso della rodamina, la sua espressione non è rilevata né nel controllo, né nei campioni trattati con E. pallida, probabilmente perché i metodi di rilevazione utilizzati riultano troppo poco sensibili o perché tale proteina sulle DC svolge una funzione diversa da quella di pompa. La proteina è individuata, infatti, mediante PCR. La sua espressione non varia significativamente nelle cellule trattate con estratto totale di E. pallida, rispetto al controllo, né allo stadio immaturo, né allo stadio maturo. Dall’analisi dell’endocitosi, in presenza di estratti totali di Echinacea al giorno +6 non sono evidenziate differenze rispetto al controllo: le cellule mostrano possedere una spiccata attività fagocitotica. Al giorno +7, invece, le cellule trattate con E. purpurea, invece, mantengono un’attività significativamente maggiore rispetto al controllo, anche se lievemente inferiore a quella mostrata allo stadio immaturo. L’attività endocitotica è mantenuta anche in presenza delle frazioni lipofila ed idrofila. Il dosaggio delle citochine è effettuato al giorno +7. Nei campioni trattati con Echinacea è riscontrato un aumento del rilascio di IL-1 e una diminuzione della concentrazione di IL-10, rispetto al controllo. Non si evidenziano differenze significative tra le tre specie utilizzate. Il nostro studio suggerisce la necessità di proseguire l’approccio investigativo, analizzando più approfonditamente l’influenza delle frazioni idrofila e lipofila degli estratti di Echinacea per confermare i dati preliminari, ma anche valutando l’effetto di singoli principi attivi estratti dalla pianta sulle cellule dendritiche. Sarebbe interessante poter identificare un’eventuale frazione o specie maggiormente responsabile degli effetti osservati. Nell’ambito delle molteplici e riportate attività farmacologiche, infatti, quella immunomodulatoria è a tutt’oggi solo parzialmente elucidata. Dai risultati presenti in letteratura e dai nostri dati sembra di fondamentale importanza comprendere quale siano i composti chimici responsabili dell’azione farmacologica di questa pianta e il meccanismo tramite cui essa si esplica.