Caratterizzazione funzionale di Rab7 e RILP, proteine associate alla malattia di Charcot Marie Tooth di tipo 2B

Il trasporto assonale ha un’importanza cruciale per i neuroni. Alterazioni in questo delicato equilibrio possono sconvolgere il traffico intracellulare fino ad innescare veri e propri processi patologici a carico del sistema nervoso. Infatti numerose forme di neuropatie, come la Charcot-Marie-Tooth , sono causate da mutazioni in geni che codificano proteine coinvolte nella stabilità dei neurofilamenti (NEFL), nel trasporto assonale (KIFIB) o nel traffico intracellulare (Klein, 2004). Recentemente due mutazioni nella proteina Rab7 sono state associate alla sindrome di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2B (Verhoeven et al., 2003) ed una terza è stata associata ad una patologia ulcero-mutilante correlabile alla CMT2B (Houlden et al., 2004). Rab7 appartiene alla famiglia delle proteine Rab (RAs-related in Brain; Touchot et al, 1987) piccole GTPasi che regolano il trasporto intracellulare. Determinare come mutazioni in Rab7 risultino in una neuropatia sensoriale e motoria e identificare come la perdita di funzione di Rab7 sia compensata nelle altre cellule, tessuti e organi rimangono questioni tutte da risolvere. La biopsia del nervo surale in pazienti affetti da queste neuropatie rivela l’assenza di espressione di RILP (Rab Interacting Lysosomal Protein) stretto collaboratore di Rab7, suggerendo che il meccanismo patogenetico possa implicare tale effettore (Houlden et al., 2004). Il mancato reclutamento di RILP potrebbe alterare il trasporto assonale tanto da bloccarlo, con tutte le conseguenze patologiche che conseguono ad una alterazione simile. Questo lavoro di tesi ha permesso di isolare e caratterizzare otto proteine che interagiscono con RILP. In particolare, cinque proteine hanno localizzazione nucleare, proponendo per RILP un ruolo anche nella segnalazione intracellulare al nucleo, così come dimostrato recentemente per altri effettori delle proteine Rab. Un’altra delle proteine isolate corrisponde alla subunità G dell’ATPasi vacuolare, suggerendo che RILP sia direttamente coinvolto anche nell’acidificazione dei compartimenti tardivi e dei lisosomi; infine un’altra proteina, completamente sconosciuta, in virtù della sua similarità alla vinculina potrebbe connettere RILP al citoscheletro di actina. Tra le proteine isolate è stata identificata la stessa proteina RILP, lasciando ipotizzare che la proteina sia in grado di dimerizzare. Infatti, una serie di esperimenti hanno permesso di dimostrare tale ipotesi e di caratterizzare i domini di RILP coinvolti nella dimerizzazione. Infine, questo lavoro di tesi ha permesso la caratterizzazione funzionale dei mutanti della proteina Rab7 associati alle neuropatie ulcero-mutilanti. In particolare, attraverso un saggio di GTP-Binding è stato possibile stabilire che tali mutanti legano, come di norma, il GTP. Pertanto l’alterazione non è dovuta alla mancata attivazione della proteina Rab7. L’analisi condotta in microscopia confocale su cellule trasfettate non ha rilevato drastici cambiamenti strutturali nei compartimenti endosomali tardivi e lisosomali, né alterazioni nel traffico endocitico di marcatori come LDL e Trasferrina. L’impiego di anticorpi diretti contro i recettori per l’NGF, TrkA e p75, ha, invece, rivelato interessanti cambiamenti morfologici nelle cellule che overesprimono i mutanti, suggerendo che il meccanismo neurodegenerativo possa essere innescato proprio da anomalie nel trasporto dei fattori neurotrofici, riconducibili all’alterato funzionamento delle proteine mutate.