Aptameri G-quadruplex ad attività anticoagulante, antiproliferativa e anti-HIV: progettazione, sintesi, caratterizzazione strutturale e valutazione dell’attività biologica

Gli aptameri sono oligonucleotidi (ODN) sintetici, a DNA o RNA, relativamente piccoli che, in virtù dell’arrangiamento conformazionale assunto, sono in grado di legare con elevata affinità e specificità un’ampia gamma di bersagli. Essi sono identificati generalmente attraverso una tecnica combinatoriale definita SELEX (Systematic Evolution of LIgands by EXponential enrichment) grazie alla quale, a partire da collezioni (library) complesse di acidi nucleici sintetici, è possibile isolare specifiche molecole dotate di elevata affinità per la molecola target. Grazie a queste caratteristiche, gli aptameri possono trovare applicazione sia in ambito terapeutico che diagnostico e rappresentano uno strumento potenzialmente utile in molti campi di ricerca. Tuttavia questi ligandi presentano grossi limiti d’impiego in vivo a causa della loro scarsa resistenza in ambiente biologico, bassa stabilità termica e bassa clearance renale. Al fine di affrontare tali limiti e chiarire le relazioni struttura-attività del complesso aptamero-target, gli ODN una volta selezionati, sono sottoposti a modifiche post-SELEX con lo scopo di ottenere analoghi dotati di affinità e specificità paragonabili o anche superiori ma con profili farmacocinetici migliori. Un largo numero di aptameri ricchi di G adotta strutture G-quadruplex. L’elevato polimorfismo delle G-quadruplex fornisce una varietà di stabili strutture dotate di specifici siti di riconoscimento sul corrispondente target. Numerosi aptameri formanti G-quadruplex rappresentano strumenti interessanti per il trattamento di malattie vascolari, tumorali e virali. In questo ambito, la mia attività di ricerca ha riguardato la sintesi di aptameri modificati formanti G-quadruplex dotati di potenziale attività farmacologica. Un aptamero G-quadruplex di cui mi sono occupata durante la mia attività di dottorato è il TBA (Thrombin Binding Aptamer), un aptamero dotato di attività anticoagulante. Di questo ligando, è stata proposta una semplice modifica che consiste nell’introduzione di un extra-residuo all’estremità 3' o in entrambe le estremità, attraverso legami fosfodiesterici 3'-3' o 5'-5'. Il vantaggio di questa modifica è che essa non solo non influenza i loop TT coinvolti nell’interazione con la proteina target ma rispetto al TBA, comporta simultaneamente un miglioramento della resistenza alle nucleasi, della stabilità termica e dell’interazione con la trombina. Una seconda modifica a carico dello stesso aptamero ha riguardato la sintesi di molecole dimeriche in cui le estremità 3’ di due sequenze di TBA sono state legate tramite linker di vario tipo. Studi elettroforetici e di dicroismo circolare (CD) suggeriscono che i vari derivati formano due domini G-quadruplex indipendenti molto simili alla struttura originaria. Tuttavia misure di calorimetria isotermica di titolazione dell’interazione ligando/trombina (ITC) hanno indicato affinità diverse in dipendenza dal tipo di linker, confermate dalle diverse attività anticoagulanti dei vari derivati, di cui alcune sono risultate migliori del TBA stesso. Un dato interessante è che i due aptameri dimerici con le migliori attività anticoagulanti sono anche risultati più resistenti del TBA alla degradazione in ambiente biologico. I risultati riguardanti queste ricerche sono discussi nel capitolo 4. In base a precedenti studi, è stato messo in evidenza che il TBA possiede anche un’attività antiproliferativa contro linee cellulari cancerose. Tuttavia il suo potenziale sviluppo in tal senso è stato rallentato proprio dalla concomitante attività anticoagulante. Con lo scopo di preparare derivati del TBA con una minore o assente attività anticoagulante, ma che conservassero le proprietà antiproliferative, sono stati sintetizzati degli aptameri analoghi contenenti vari tipi di timidine. In particolare i derivati contenenti 5-idrossimetiluridina nelle posizioni 4 e 13 hanno perso l’attività anticoagulante conservando quella antiproliferativa verso due linee cellulari cancerose. Nell’ambito della stessa tematica di ricerca sono stati preparati derivati del TBA contenenti siti di inversione della polarità e/o residui L. In base al tipo di sequenza i dati CD e NMR indicano che i derivati adottano strutture G-quadruplex destrorse o sinistrorse. Tutti gli analoghi del TBA hanno perso l’attività anticoagulante ma molti posseggono significative proprietà antiproliferative contro due linee cellulari cancerose ed una notevole resistenza in siero fetale bovino, che mima l’ambiente fisiologico. I risultati di questi studi sono descritti nel capitolo 5, sezioni 5.1 e 5.2. L’introduzione di siti di inversione della polarità in conformazioni G-quadruplex è stata sfruttata anche per incrementare la loro variabilità strutturale. A questo scopo sono stati preparati e studiati tramite CD, NMR ed elettroforesi tre ODN contenenti quattro tratti di G con un numero variabile di residui (da 2 a 4) e tre siti di inversione della polarità. Due di questi sono in grado di formare strutture G-quadruplex monomolecolari parallele dotate di una eccezionale stabilità termica. Tutti gli ODN hanno mostrato una promettente attività antiproliferativa contro linee cellulari di cancro polmonare e al colon e per due in particolare è stata dimostrata una elevata resistenza in siero fetale bovino, come riportato nel capitolo 5, sezione 5.3. Un altro aptamero G-quadruplex su cui si è concentrata la mia attività di ricerca è il T30175, in grado di inibire l’integrasi del virus HIV-1. Considerando che in lavori precedenti era stata messa in evidenza l’importanza dei loop per l’interazione con la proteina target, sono stati preparati dei derivati in cui ciascuna timidina del loop è stata sostituita con un residuo di 5-idrossimetiluridina, potenzialmente in grado di stabilire ulteriori contatti con la proteina target. Indagini strutturali basate su tecniche NMR, CD, elettroforetiche ed analisi termodinamiche hanno indicato che la modifica non è in grado di alterare la capacità degli ODN di formare la struttura dimerica non covalente con G-quadruplex parallele, tipica della sequenza naturale. Tuttavia, alcuni aptameri modificati hanno mostrato una migliore capacità di inibire l’HIV-integrasi rispetto all’aptamero originale. Inoltre studi di molecular modelling hanno messo in evidenza la capacità delle timidine modificate di stabilire diversi contatti con la proteina target, come descritto nel capitolo 6.