Optimizacion de la congelacion y vitrificacion de esperma de asno "Optimization of donkey sperm freezing and vitrification"

RIASSUNTO L'inseminazione artificiale (IA) e la crioconservazione del seme sono le tecniche di riproduzione assistita più efficaci per il mantenimento della diversità genetica e la conservazione delle specie e razze in via di estinzione, tra cui la maggior parte delle razze di asini in Europa. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare il congelamento e la vitrificazione convenzionale dello sperma di asino, come metodi alternativi di crioconservazione, evitando l'uso di agenti crioprotettivi permeabili (CPA). Nel Capitolo 1 è stato valutato l'uso esclusivo di CPA non permeabili a diverse concentrazioni per il congelamento convenzionale. Utilizzando un diluente con saccarosio 0,25 molare (M) combinato con albumina di siero bovino i parametri spermatici ottenuti (motilità, integrità della membrana plasmatica e DNA), sono risultati simili a quelli ottenuti dopo il congelamento convenzionale con glicerolo in asini fertili. Tuttavia, negli asini subfertili nessuna concentrazione di saccarosio ha prodotto valori simili a quelli ottenuti dopo il congelamento convenzionale. Nel Capitolo 2 è stata sviluppata la tecnica di vitrificazione in sfere (pellets), ottenuta facendo cadere gocce di seme di asino in azoto liquido. Il saccarosio e l'albumina sierica bovina aggiunti al diluente come CPA non permeabili sono risultati in migliori caratteristiche spermatiche dopo lo scongelamento rispetto all'uso di diluenti con glicerolo. Il Capitolo 3 è stato disegnato per sviluppare e ottimizzare la tecnica di vitrificazione dello sperma degli asini usando paillettes. I risultati migliori sono stati ottenuti quando è stato usato un volume fino a 160 µl, concentrazione di 300 milioni di spermatozoi/mL e paillettes da 0.25 mL. Le migliori percentuali di motilità totale (55.7 ± 16.4%) e progressiva (44.0 ± 11.5%) dopo la vitrificazione sono state ottenute utilizzando un diluente con tuorlo d'uovo e saccarosio. Il metodo di vitrificazione nelle paillette ha ottenuto percentuali più elevate di motilità dello sperma rispetto alla vitrificazione nelle sfere. Nel Capitolo 4 è stata testata la vitrificazione usando volumi di seme maggiori e paillettes da 0.5 mL. I parametri dopo lo scongelamento sono risultati migliori usando velocità di scongelamento elevate, ma sono risultati peggiori rispetto al congelamento convenzionale. Nel Capitolo 5, la tecnica ottimizzata per la vitrificazione nelle paillette in 0.25 mL è stata confrontata con la tecnica convenzionale di congelamento del seme con glicerolo per quanto riguarda alla qualità dello sperma e la fertilità. Le paillette vitrificate possono essere riscaldate direttamente a 43 ºC/10 s, ottenendo parametri spermatici dopo lo scongelamento simili a quelli ottenuti con il metodo convenzionale per la motilità totale (52.7 ± 15.6 % vs. 58.2 ± 16.1 %), motilità progressiva (44.3 ± 15.0 % vs. 44.7 ± 18.2 %), integrità della membrana plasmatica (49.2 ± 11.2 % vs. 55.4 ± 9.0 %) e integrità della membrana acrosomiale (45.0 ± 11.0 % vs. 38.4 ± 19.6 %), rispettivamente. L'endometrite dopo IA è risultata simile utilizzando entrambi i trattamenti di congelamento, ma la infiammazione uterina si è risolta più velocemente utilizzando sperma vitrificato. I tassi di gravidanza sono stati più alti utilizzando sperma vitrificato (22%) rispetto a quelli congelati (10%), ma le differenze non erano statisticamente significative. Questi risultati confermano la possibilità di utilizzare la vitrificazione del seme di asino come alternativa al congelamento convenzionale. SUMMARY Assisted reproductive technologies such as artificial insemination (AI) and semen cryopreservation are important tools to maintain the genetic diversity and preserve endangered species, including most of the European donkey breeds. The aim of this Thesis was to develop conventional freezing and vitrification, avoiding the use of permeable cryoprotectant agents (CPAs), as alternative methods for donkey sperm cryopreservation. In Chapter 1, the sole use of non-permeable CPAs at different concentrations were evaluated for conventional freezing. Sucrose 0.25 molar (M) combined with bovine serum albumin showed similar sperm quality (motility, plasma membrane and DNA integrity) after thawing than conventional freezing with glycerol for fertile donkeys, but is not an option for subfertile ones. In Chapter 2, vitrification in spheres by directly dropping the sperm into the liquid nitrogen was performed for the first time in donkey sperm. Sucrose and bovine serum albumin as non-permeable CPAs resulted in better sperm parameters after warming than the use of extenders containing glycerol. Chapter 3 was designed to develop and optimize a donkey sperm vitrification protocol using straws. It was shown that volumes up to 160 µL could be vitrified at 300 million sperm/mL using 0.25 mL straws with outer covers. Best percentages of total (55.7 ± 16.4 %) and progressive (44.0 ± 11.5 %) sperm motility after vitrification were found using an extender containing egg-yolk and sucrose. Vitrification in straws showed higher motility results when compared to spheres method. In Chapter 4, vitrification of larger volumes of sperm in 0.5 mL straws was tested. Although high warming rates seemed to be more adequate, sperm parameters after vitrification were lower when compared to conventional freezing. In Chapter 5, conventionally frozen and optimized vitrified donkey sperm in straws were compared in terms of sperm quality and fertility. It was found that straws could be directly vitrified and warmed in a water bath at 43 ºC/10 s obtaining similar sperm parameters as conventional freezing-thawing for total motility (52.7 ± 15.6 % vs. 58.2 ± 16.1 %), progressive motility (44.3 ± 15.0 % vs. 44.7 ± 18.2 %), plasma membrane integrity (49.2 ± 11.2 % vs. 55.4 ± 9.0 %) and acrosome integrity (45.0 ± 11.0 % vs. 38.4 ± 19.6 %), respectively. Uterine inflammatory response after AI was similar using vitrified or frozen semen, but uterine reaction solved faster using vitrified semen. Pregnancy rates were greater for vitrified (22 %) than frozen semen (10 %) but not statistically different. These findings confirm the possibility to use vitrified semen as an alternative for AI in jennies.