Studio delle proprietà funzionali di una libreria peptidica a sequenza casuale : implicazioni per lo studio dell'origine della vita

La scienza assume che la vita sulla Terra abbia avuto origine attraverso un processo spontaneo di autorganizzazione ed aumento di complessità a partire dalla materia inanimata. Diverse teorie sono state proposte per spiegare questo spontaneo aumento di complessità. Wächtershäuser identifica cicli metabolici privi di enzimi come il cardine alla base dell’ origine della vita; Kauffmann propone cicli di peptide auto-catalitici come il principale motore, mentre Cech individuò in molecole auto replicanti di RNA la struttura fondamentale del primo sistema con proprietà “viventi”. Al contrario, Luisi identifica nella struttura autopoietica dei sistemi viventi il principio primo, mentre Lancet enfatizza l’ereditarietà composizionale come caratteristica saliente dei sistemi viventi. Nonostante le differenze, tutte le teorie devono affrontare la stessa questione fondamentale: è il percorso di transizione alla vita univocamente determinato dalla legge della fisica e della chimica? Oppure è piuttosto il risultato della simultanea interazione di diversi fattori contingenti? La controversia tra determinismo e contingenza emerge con forza se si considera l'emergere di biopolimeri funzionale nel quadro di origine della vita. Infatti, l'intera architettura della vita si basa su biopolimeri così che l'eziologia dei biopolimeri rappresenta un problema cruciale nel settore della ricerca sull’origine della vita. La questione principale è come biopolimeri funzionale siano stati selezionati in condizioni pre- o protobiotiche. Infatti, il numero di sequenze teoricamente possibile cresce esponenzialmente al crescere della lunghezza raggiungendo rapidamente cifre astronomiche così che non è ragionevole assumere che l’intero spazio delle sequenze sia stato esplorato durante l’evoluzione prebiotica. Da questa osservazione nasce l’interrogativo di come siano stati selezionati biopolimeri funzionali in un contesto prebiotico. Vi sono forse principi chimico-fisici particolari che sottendono alla selezione di biopolimeri funzionali? O piuttosto l’evoluzione molecolare è il risultato dell’interazione di fattori contingenti? Nel tentativo di rispondere a queste domande una libreria di sequenze peptide completamente casuale è stata sintetizzata e studiata per le sue proprietà funzionali al fine di verificare la possibilità di isolare nuove sequenze funzionali che non presentassero omologie con quelle presenti in natura. La libreria è stata progettata senza vincoli strutturali o sequenza in modo che possa essere ragionevolmente considerata come omologa ad una popolazione di peptidi prodotta in condizioni prebiotiche. La strategia sperimentale adottata ha utilizzato la tecnica dell’evoluzione in vitro che permette di testare simultaneamente un numero consistente di sequenze diverse al fine di individuare quelle che soddisfano un particolare criterio di selezione. L’evoluzione in vitro mima l’evoluzione naturale tramite cicli iterativi di mutazione-selezione-amplificazione. Ci sono due requisiti fondamentali per applicare l’evoluzione in vitro: il primo è la possibilità di creare un legame diretto tra genotipo e fenotipo. Il secondo si basa sulla disponibilità di una idonea procedura di screening per selezionare le sequenze che soddisfano i criteri di selezione. In questo progetto di dottorato la connessione tra genotipo e fenotipo è stata ottenuta utilizzando la tecnica del phage display, mentre la capacità di legare un analogo dello stato di transizione (TSA) per la reazione di idrolisi di esteri ed ammidi è stata utilizzata come criterio di selezione. La probabilità di successo in un esperimento di evoluzione in vitro è direttamente correlata alla complessità totale della libreria ed alla robustezza del processo di selezione. Conseguentemente, la prima parte di questo progetto di dottorato è stata dedicata alla costruzione di librerie di DNA codificanti peptidi a sequenza casuale di 20 residui e all'ottimizzazione della tecnica del phage display. Infine si è proceduto allo screening di suddetta libreria per la capacità di legare il TSA vincolante peptidi in diverse condizioni chimiche. La costruzione di librerie peptidiche pone una serie di problemi tecnici che limitano la loro applicabilità, per ovviare a queste limitazioni un nuove vettore fagemidico è stato sviluppato per consentire la costruzione di librerie altamente degeneri e diverse. I risultati ottenuti sono riassunti qui di seguito: Complessità della libreria @ 108 Diversità della libreria > 70% Copertura dello Sequenza delle spazio @ 10-56 Un ulteriore problema inerente la tecnologia del phage display risiede nella eterogeneità della popolazione fagica. Tale eterogeneità limita severamente la porzione di spazio delle sequenze effettivamente esplorabile e riduce drasticamente la possibilità di trovare funzioni rare come quella catalitica. Per ovviare a questi limiti è stata condotta un’ottimizzazione del processo di produzione e purificazione dei fagi che garantisse l’omogeneità del prodotto. I risultati ottenuti sono riassunti qui di seguito: Rapporto tra fagi ricombinante e non ricombinante aumentato di un fattore 10 rispetto agli standard commerciali e di letteratura. Rapporto tra genotipo wild-type e genotipo ricombinante ridotto del 33% La libreria è stata quindi sottosta a screening per il legame al TSA in diverse condizioni chimica ed in particolare a diversi pH (da 4 a 10) e concentrazione di zinco (0 mm a 10 mm). per mezzo di 4 cicli iterativi di selzioneamplificazione (biopanning). Al contempo, le condizioni di selezione, forza ionica e concentrazione di detergente, sono state modulate per minimizzare il binding aspecifico. Infine, i tempi di incubazione ed eluizioni sono stati modificati nei diversi cicli di biopanning per favorire il ricupero di peptidi con costanti di affinità basse. Il sequenziamento di cloni selezionati ha rivelato la presenza di pattern conservati al N- e C-terminale e la presenza di residui acidi a valle della regione N-terminale. L’analisi delle sequenze non hanno evidenziato altri pattern conservati ad eccezion fatta di quelli sopramenzionati. L’allineamento delle sequenze ha evidenziato una distribuzione isotropica delle stesse nello spazio delle sequenze. Inoltre, i risultati mostrano come il legame all’aptene sia favorito a bassi pH e non sia influenzato dalla concentrazione di zinco. Questi risultati mostrano che è possibile recuperare selettivamente peptidi funzionali capaci di legare il TSA in diverse condizioni chimiche anche se emerge chiaramente che alcune condizioni (i.e. pH>4) risultano in una selezione non ottimale. Inoltre, l’analisi delle sequenze mostra una notevole eterogeneità dei peptidi selezionati che suggerisce che vi siano diverse famiglie di sequenze non omologhe capaci di legare il TSA. Nel loro complesso i risultati suggeriscono che biopolimeri funzionali diversi da quelli presenti in natura sono uniformemente distribuiti nello spazio delle sequenze a sostegno della teoria della contingenza.