VALUTAZIONE DI BIOMARCATORI COME POTENZIALI INDICATORI DIAGNOSTICI E PROGNOSTICI IN CAVALLI AFFETTI DA SIRS

I biomarkers sono impiegati ampiamente sia in medicina umana che veterinaria, con lo scopo sia di identificare precocemente i casi patologici occulti, sia di escluderli con certezza. Inoltre, i biomarkers dovrebbero poter dare informazioni riguardo l’evoluzione durante il ricovero e l’outcome finale della patologia, così da integrare il giudizio clinico al fine impiegare precocemente procedure diagnostiche e terapeutiche adeguate (Barton et al., 2016). Il presente lavoro di ricerca si pone l’obiettivo di valutare tre potenziali molecole biomarker nella specie equina. In particolare, la valutazione è stata eseguita in soggetti sani e soggetti patologici in SIRS (Systemic inflammatory response syndrome), con particolare attenzione per i soggetti affetti da colica. Progetto 1. In medicina veterinaria, la procalcitonina (PCT) si è dimostrata biomarker sensibile delle infezioni batteriche con coinvolgimento sistemico e presenta un significativo aumento della sua concentrazione plasmatica in sepsi, SIRS e patologie respiratorie e gastrointestinali in bovini, cavalli adulti e puledri. Il presente studio ha valutato le concentrazioni di PCT in cavalli sani a confronto con cavalli affetti da colica SIRS negativi e positivi, valutando la sua variazione durante il tempo di ricovero. Inoltre, ha indagato una possibile correlazione fra il punteggio SIRS e i valori di PCT, per verificare un’eventuale utilità nella valutazione della gravità di SIRS. A questo scopo sono stati inclusi 91 cavalli, di cui 43 sani e 48 patologici affetti da colica. All’ammissione in clinica sono stati sottoposti ad esame clinico, valutazione degli esami del sangue e calcolo del punteggio SIRS. La valutazione della concentrazione plasmatica di PCT è stata eseguita al momento dell’ammissione (unico prelievo per i sani) e a 24, 48, 72 e 96 ore dall’inizio del ricovero (per i patologici). I risultati mostrano una differenza significativa fra i soggetti sani e il totale dei cavalli patologici, SIRS positivi e SIRS negativi, a tutti i tempi di ricovero. Infine, non è stata evidenziata nessuna correlazione né fra sani e SIRS-negativi né fra il punteggio SIRS e i valori di PCT, giustificabile considerando il basso grado di coinvolgimento sistemico da parte del processo infiammatorio. I nostri risultati mostrano valori di PCT statisticamente più elevati in cavalli in colica (sia in SIRS positivi che negativi) rispetto ai sani. Questo suggerisce un possibile ruolo come biomarker per la colica nel cavallo. Progetto 2. In medicina umana, la carbonilazione proteica (PCC) è stata valutata come marker di infiammazione sistemica e sviluppo di danno ossidativo (Costa et al., 2018). In medicina veterinaria, sono stati evidenziati valori elevati di PCC in cani in SIRS e sepsi e in articolazioni patologiche nel cavallo (Ruggerone et al., 2018; Dimock et al., 2000). Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la concentrazione ematica di PCC in cavalli adulti sani e patologici in SIRS e di valutare le performance di PCC in termini di sensibilità, specificità, rapporto di verosimiglianza nell’identificazione dei soggetti SIRS. Sono stati inclusi 72 cavalli, che sono stati sottoposti ad esame clinico completo, valutazione degli esami del sangue e calcolo del punteggio SIRS. I campionamenti ematici per PCC sono stati eseguiti una volta sola per i soggetti sani, mentre per i patologici, al mento dell’ammissione (T0), a 24, 48, 72 e 96 ore dall’ammissione. La metodica già proposta in letteratura (Levine, 1990) è stata impiegata per la valutazione di PCC. I risultati sono stati espressi in nmol/ml/mg e i dati sono stati valutati statisticamente per studiare eventuali differenze nei valori di PCC fra i soggetti sani e SIRS positivi e negativi, per tutti i tempi di campionamento. La curva ROC è stata valutata per verificare la sensibilità e specificità di PCC nella diagnosi di SIRS positivi e negativi. I sani erano 18/72 femmine trottatrici, età media 8.5 anni. I patologici erano 31/54 femmine, 16/54 castroni e 7/54 stalloni, di differenti razze, età media 12 anni, di cui 8/54 erano SIRS negativi e 46/54 SIRS positivi. Differenze statisticamente significative sono state ottenute fra i sani e i SIRS positivi, nessuna differenza invece fra i sani e i SIRS negativi a nessun tempo di campionamento. È stato riportato il valore cut-off migliore per distinguere fra SIRS positivi e negativi e sani, di sensibilità e specificità, l’area sotto la curva ROC; l’intervallo di confidenza al 95% e il rapporto di verosimiglianza. Lo studio rivela valori di PCC più elevati in SIRS positivi rispetto ai sani con valori che decrescono nel tempo, nessuna differenza è stata invece riscontrata fra i SIRS negativi e i sani. Il valore 0.049 nmole/ml/mg è stato individuato come potenziale cut-off per la diagnosi di SIRS positivi, con sensibilità del 74.5% e specificità del 72.2%. Progetto 3. La paraoxonasi 1 (PON1) sierica è un enzima, associato alle lipoproteine ad alta densità, studiato in medicina umana e veterinaria per la valutazione dello stato ossidativo durante l’infiammazione. La PON1 è stata misurata nel cavallo ma il suo potenziale ruolo di biomarker infiammatorio è sconosciuto. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la sensibilità, specificità, e il rapporto di verosimiglianza dell’attività di PON1 nell’identificazione di SIRS nel cavallo e di valutarne la capacità prognostica. Sono stati inclusi 58 cavalli patologici, i quali sono stati sottoposti a visita clinica, esami del sangue e valutazione del punteggio SIRS. La PON1 è stata valutata all’ammissione, a 24, 48, 72, e 96 ore dopo l’inizio del ricovero. I risultati sono stati valutati basandosi sul punteggio SIRS e sull’outcome. Non sono state riscontrate differenze statistiche in PON1 fra i soggetti SIRS positivi e negativi, e fra i sopravvissuti e i non sopravvissuti, mentre per le femmine la PON1 è risultata inferiore nei SIRS positivi (p=0.05). La sensibilità di PON1 nell’identificazione dei cavalli con SIRS o con prognosi infausta è risultata bassa (0.0%-46.2%) mentre la specificità alta (87.0%-100.0%). Inoltre, con valori bassi di PON1 la probabilità di esito infausto è 2.40-3.89 volte più elevata della probabilità di sopravvivenza. Misurazioni ripetute di PON1, dopo l’inizio del trattamento non sono risultati prognostici. La valutazione di PON1 in SIRS è un potenziale biomarker di largo impiego in futuro, ma solo una bassa attività all’ammissione può essere rilevante nel riconoscere SIRS o un esito infausto. In base ai risultati ottenuti, i biomarker analizzati hanno ottenuto buoni risultati per il riconoscimento della condizione di infiammazione sistemica e ciò potrebbe suggerire un loro uso come potenziali indicatori prognostici. Biomarkers have been widely used in human and vet, in order to early detect specific pathologies and promptly start with the appropriate treatment. Furthermore, biomarkers have been used as a helpful tool to get information on severity and outcome of the diseases (Barton et al., 2016). The present research project aims to evaluate three potential biomarkers in healthy horses and in pathologic horse with systemic inflammatory response syndrome (SIRS), in particular in horses affected by colic. Project 1. In veterinary medicine, procalcitonin (PCT) has been shown a sensible and specific biomarker for bacterial infections; in particular, PCT increases during sepsis, SIRS, respiratory and gastrointestinal diseases, in bovine, horses and foals. The present study aims to evaluate PCT blood concentration in healthy horses and in SIRS positive and negative colic horses, assessing blood concentration during recovery and in relation to SIRS score. Ninety-one horse were included, 43/91 were healthy and 48/91 were affected by colic. At admission at clinic, horses underwent a complete physical examination, blood work and SIRS score was calculated. A blood samples were withdrawn once for the control group and at admission, at 24, 48, 72, 96 hours after admission for the pathological group. Statistically differences were detected between healthy vs all colic horses and between healthy vs SIRS positive or SIRS negative horses. No correlation was observed between SIRS score and PCT. Our results showed that PCT was statistically higher in colic horses (both SIRS positive or SIRS negative) compared to the healthy ones. This suggests a role of plasmatic PCT as good biomarker for colic. The lack of correlation between SIRS score and plasma PCT levels should be investigated in further studies in which SIRS score will be evaluated throughout the whole hospitalization period. Project 2. The protein carbonylation content (PCC) has been related to inflammation and development of oxidative stress, both in human and dogs. Literature on PCC evaluation in horses is scarce, thus the aims were to evaluate the PCC in healthy and SIRS horses and to investigate the performances of PCC in terms of sensitivity, specificity and likelihood ratio in identifying SIRS positive and negative horses. A total of 72 adult horses were included. All the horses underwent to a complete physical examination, blood work analysis and were evaluated for the SIRS status. Blood samples were collected once in healthy horses and at admission time, then 24, 48, 72 and 96 hours after admission in sock animals. PCC was evaluated using a method previously described. The results were expressed as nmol/ml/mg. Data were statistically analyzed to verify differences in PCC between healthy vs SIRS positive or SIRS negative horses at all sampling time. The ROC curve was performed to verify sensitivity and specificity of PCC in the diagnosis of SIRS-positive and SIRS negative horses. The healthy horses were standardbred mares with a median age of 8.5 years. The sick horses were 31/54 females, 16/54 geldings and 7/54 stallions of different breeds and with a median age of 12 years old. Eight out of 54 sick horses were SIRS negative, while 46/54 were SIRS positive. Statistically significant differences were obtained between healthy and SIRS positive horses, while no differences were observed between healthy and SIRS negative horses at any sampling time. The best cut-off value of PCC to discriminate between SIRS positive, SIRS negative and healthy horses, the sensitivity and specificity of cut-off point, the area under receiver operating characteristic curve, the 95% confidence intervals and the likelihood ratio were reported. We found higher PCC values in sick SIRS-positive horses vs healthy ones with a decrement over time, while no differences at admission, nor during the observational period were obtained in sick but SIRS-negative horses. The value of 0.049 nmole/ml/mg is reported as a potential cut-off for the diagnosis of SIRS positivity vs healthy horses with a sensibility of 74.5% and a specificity of 72.2%. In conclusion, PCC seems to be a sensitive and specific marker for SIRS in horses Project 3. In several species, paraoxonase-1 (PON-1) decreases during inflammation, because of the presence of oxidative stress; its measurement recently has been validated in horses, but its role as a clinical biomarker is unknown. The aims of the present study was to evaluate sensitivity, specificity and likelihood ratio of PON-1 activity to identify SIRS-positive horses or horses with a poor prognosis. One hundred seventy-two blood samples from 58 sick horses were included, referred from 3 different veterinary hospitals. PON-1 activity was measured upon admission and at 24-hour intervals until discharge or death, and results were analyzed based on SIRS status and outcome. No statistically significant difference was found in median PON-1 activity between SIRS and non-SIRS cases or between survivors and non-survivors except for mares, in which PON-1 activity was significantly lower in SIRS-positive horses (P = .05). The sensitivity of PON-1 activity in identifying horses with SIRS or negative outcome was low (0.0%-46.2% depending on the examined group) but its specificity was high (87.0%-100.0%). However, when PON-1 is low, the likelihood of death is 2.40-3.89 times higher than the likelihood of survival. Repeated measurement ofPON-1 after treatment does not predict outcome. In conclusions, the biomarkers evaluated in the present research project have shown good results in detecting systemic inflammation in colic horses. Thus, they might be considered promising markers for prognosis and outcome.