LO STRESS OSSIDATIVO NEL MORBO DI BASEDOW E NELL'OFTALMOPATIA BASEDOWIANA

RIASSUNTO Il morbo di Basedow è una malattia autoimmune caratterizzata dalla produzione di autoanticorpi diretti contro il recettore del TSH (TRAb). che, determinano un’ aumentata sintesi e secrezione di ormoni tiroidei (ipertiroidismo) e lo sviluppo di gozzo. L’aumento della concentrazione degli ormoni tiroidei circolanti (triiodotironina e tiroxina) causa una serie di alterazioni a carico di quasi tutto l’organismo, da cui derivano i segni e sintomi tipici di questa condizione. È stato ipotizzato che lo stress ossidativo possa essere uno dei meccanismi patogenetici del morbo di Basedow: i radicali liberi dell’ossigeno potrebbero sia intensificare la risposta autoimmune a livello intratiroideo, che essere uno dei mediatori di ipertiroidismo in periferia. Il 25-30% dei pazienti con morbo di Basedow presenta l’oftalmopatia basedowiana, una sindrome oculare le cui manifestazioni cliniche possono variare a seconda dell’estensione dell’interessamento dei vari tessuti orbitari e della sua e gravità. Anche in questo caso, un ruolo patogenetico non marginale sembra essere svolto dallo stress ossidativo, dovuto principalmente al rilascio locale di radicali liberi. Sulla base di questa evidenza, è stato ipotizzato l’utilizzo di sostanze anti-ossidanti come terapia per i pazienti con OB. Un recente studio randomizzato multicentrico ha dimostrato un benefico del selenio, un noto anti-ossidante, sulle manifestazioni cliniche dell’OB lieve. Il selenio, è un micronutriente essenziale, che in natura si rinviene in numerosi alimenti, sia in forma inorganica come selenite, sia in forma organica come selenometionina e selenocisteina. Il selenio esercita i suoi effetti biologici soprattutto mediante accoppiamento con sostanze proteiche, con formazione delle cosiddette selenoproteine, le principali delle quali sono gli enzimi glutatione per ossidasi (GPX), tioredoxina, tioredoxina reduttasi e iodotironina. Nella presente tesi sono riportati i risultati di uno studio clinico e di uno studio di laboratorio sull’uso del selenio rispettivamente nell’ipertiroidismo da morbo di Basedow e nell’OB. Lo scopo dello studio clinico era di valutare se l’associazione terapeutica selenio-metimazolo si dimostrasse più efficace della terapia con solo metimazolo nel controllo biochimico e nelle manifestazioni cliniche dell’ipertiroidismo. Lo scopo dello studio di laboratorio era di valutare se il selenio svolge un effetto protettivo in colture primarie di fibroblasti orbitari provenienti da pazienti con OB sottoposti a stress ossidativo. Studio clinico Veniva progettato uno studio randomizzato in aperto per valutare l’efficacia di 2 diversi protocolli di terapia dell’ipertiroidismo in pazienti con ipertiroidismo non trattato: i) metimazolo ii) metimazolo associato a selenio. Gli obiettivi primari erano: i) Andamento delle manifestazioni cliniche dell’ipertiroidismo a 90 giorni; ii) Andamento dei parametri biochimici dell’ipertiroidismo a 90 giorni. Gli obiettivi secondari erano: i) Andamento delle manifestazioni cliniche dell’ipertiroidismo a 45 giorni; ii) Andamento dei parametri biochimici dell’ipertiroidismo a 90 giorni; iii) Andamento dei parametri di stress ossidativo a 45 e a 90 giorni; iv) Andamento dei TRAb; v) Rilevazione degli eventuali effetti collaterali della terapia con selenio. Trenta pazienti venivano reclutati , randomizzati ed assegnati ad uno dei 2 gruppi di studio. Lo studio ha avuto una durata di 90 giorni per ogni paziente. I risultati non mostravano differenze tra i due gruppi di terapia, infatti, sia a 45 che 90 giorni, il selenio non sembrava influenzare l’efficacia della terapia con metimazolo sulla funzione tiroidea e sulle manifestazioni di ipertiroidismo a breve termine. Studio di laboratorio Campioni di tessuto fibroadiposo orbitario venivano prelevati da 6 pazienti con OB sottoposti ad orbitotomia decompressiva. Campioni di tessuto orbitario normale venivano prelevati da 6 pazienti sottoposti a chirurgia oculare per ragioni non correlate. Venivano preparate colture primarie di fibroblasti. Al fine di indurre stress ossidativo, le cellule venivano incubate con H2O2. Negli esperimenti volti a valutare gli effetti del selenio, le cellule venivano pre-incubate con selenio o, come controllo, con metilcisteina (MCys). Venivano valutati la vitalità, il Glutatione disolfuro (GSSG) come misura dello stress ossidativo, la proliferazione cellulare, il rilascio di acido ialuronico (HA) e di alcune citochine pro-ifnaimamatorie, ovvero TNF-IL1 and IFN. Dopo incubazione dei fibroblasti con H2O2. si osservava un aumento della GSSG che veniva abolito dalla pre-incubazione con selenio, sia nei fibroblasti OB che nei fibroblasti di controllo, senza differenza tra i due gruppi. La proliferazione dei fibroblasti orbitari è probabilmente il principale meccanismo patogenetico nell’OB. Pertanto, veniva valutato l’effetto di H2O2 e del selenio sulla proliferazione stessa. L’H2O2 determinava un incremento significativo nella proliferazione cellulare nei fibroblasti OB ma non nei fibroblasti di controllo. Il selenio, ma non la MCys, annullava l’incremento della proliferazione indotto dall’H2O2 nei fibroblasti OB, ma non nei fibroblasti di controllo. La proliferazione era significativamente maggiore nei fibroblasti OB che nei fibroblasti di controllo, indipendentemente dalle condizioni di incubazione. Oltre alla marcata proliferazione, i fibroblasti orbitari nell’OB hanno la caratteristica di produrre una grande quantità di glicosaminoglicani, soprattutto HA, che contribuiscono all’incremento del contenuto orbitario. Nel presente studio veniva valutato l’effetto dell’ H2O2 e del selenio sul rilascio di HA da parte dei fibroblasti. L’HA nel supernatante era significativamente maggiore nei fibroblasti OB rispetto ai fibroblasti di controllo, indipendentemente dalle condizioni di incubazione. L’H2O2 non influenzava in modo significativo il rilascio di HA sia nei fibroblasti OB che in quelli di controllo. Tuttavia il selenio riduceva in modo significativo il rilascio di HA rispetto alle cellule trattate con H2O2 nei fibroblasti OB, mentre non aveva effetti nei fibroblasti di controllo. La MCys non determinava alcun effetto in entrambi i tipi di cellule. È noto che lo stress ossidativo si associa ad un incremento nel rilascio di citochine pro-infiammatorie da parte dei fibroblasti, e che questo è uno dei meccanismi attraverso i quali lo stress ossidativo contribuisce alla patogenesi dell’OB. In questo studio venivano valutato gli effetti del selenio sul rilascio di citochine infiammatorie in seguito all’insulto indotto dall’ H2O2. Il TNF- aumentava in modo significativo in seguito al trattamento con l’H2O2 sia nei fibroblasti OB che in quelli di controllo. Tale effetto veniva ampiamente ridotto dal selenio, ma non dalla MCys, in entrambi i tipi cellulari, senza differenze tra i fibroblasti OB e quelli di controllo. Al contrario, il selenio non aveva effetti sul rilascio di IL1. Infine, venivano eseguiti gli stessi esperimenti per valutare l’effetto dell’ H2O2 e del selenio sul rilascio di IFN Il rilascio di IFN veniva significativamente incrementato dall’H2O2 sia nei fibroblasti OB che in quelli di controllo. Il selenio, ma non la MCys, riduceva in misura significativa l’effetto dell’H2O2 sia nei fibroblasti OB che in quelli di controllo senza differenze tra i due tipi di cellule. Questo studio dimostra un’azione antiossidante del selenio nei fibroblasti orbitari, che fornisce una possibile base cellulare per gli effetti del selenio osservati in vivo in pazienti con OB.