Studi di farmacologia preclinica e farmacogenetica di gemcitabina e pemetrexed in tumori pancreatici

In questa tesi sono stati condotti studi sperimentali per chiarire il ruolo dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed nell'effetto citotossico di tali chemioterapici, e per caratterizzarne il profilo farmacogenetico in linee cellulari e tessuti neoplastici pancreatici. La gemcitabina e il pemetrexed hanno determinato un’inibizione di tipo dose-dipendente della proliferazione cellulare, con valori di IC50 rispettivamente di 2,90±0,34 e 1,58±0,40 mg/ml nelle cellule MIA PaCa-2, 42,21±5,74 e 2,42±0,29 mg/ml nelle PANC-1, 4,75±1,07 e 7,33±1,93 mg/ml nelle Capan-1. I due farmaci in associazione hanno mostrato il più spiccato effetto sinergico citotossico (CI<1) quando impiegati nella sequenza in cui il pemetrexed precede la gemcitabina in tutte le cellule pancreatiche. L’analisi del ciclo cellulare ha dimostrato che l’esposizione al pemetrexed determina un incremento della percentuale di cellule in fase S in tutte le linee cellulari in esame; risultati simili sono stati ottenuti anche con l’esposizione alla gemcitabina. Inoltre il trattamento con pemetrexed e con gemcitabina ha causato la riduzione della quantità di Akt fosforilata. L’associazione dei due farmaci ha prodotto un aumento statisticamente significativo (P<0,05) dell’indice apoptotico rispetto ai controlli in tutte le linee cellulari in studio. Per quanto riguarda gli studi con gli inibitori enzimatici, l’effetto citotossico della gemcitabina è stato ridotto in modo significativo dalla deossicitidina, mentre l’inibizione degli enzimi CDA e 5’-NT ha prodotto un potenziamento dell’attività farmacologica. Gli studi di inibizione della citotossicità del pemetrexed hanno invece dimostrato il ruolo di TS, DHFR e GARFT nel meccanismo d'azione di tale chemioterapico. Infine, l’analisi con PCR quantitativa ha permesso di correlare i livelli di espressione dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione dei due chemioterapici con i valori di IC50 registrati negli esperimenti di citotossicità, e ha dimostrato che l’esposizione al pemetrexed induce un incremento statisticamente significativo dell’espressione genica di hENT1 e dCK in tutte le linee cellulari. Utilizzando la stessa metodica è stata anche valutata l’espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d’azione di gemcitabina e pemetrexed nei campioni tissutali, dimostrandone l’ampia variabilità, evidente soprattutto per gli enzimi dCK, CDA, TS e FPGS. Lo studio clinico ha rivelato una discreta variabilità dell’espressione genica dei determinanti in studio nei tessuti microdissecati. La successiva stratificazione degli 81 pazienti trattati con gemcitabina in base ai livelli di espressione di ciascu determinante ha pemesso di dimostrare una associazione statisticamente significativa fra l’espressione di hENT1 e la sopravvivanza. Conclusioni. I risultati del presente studio permettono di affermare che l’associazione tra pemetrexed e gemcitabina ha un’elevata attività antitumorale in linee cellulari di tumore pancreatico, risultante da interazioni favorevoli a livello della modulazione del ciclo cellulare, dell’induzione di apoptosi e dell’influenza sull’espressione di geni coinvolti nel meccanismo d’azione dei farmaci. L’analisi dei livelli di espressione dei suddetti determinanti in adenocarcinomi pancreatici ha rivelato la correlazione fra l’espressione di hENT1 e la sopravvivenza di pazienti trattati con gemcitabina. Questi dati rappresentano pertanto la base scientifica per lo sviluppo razionale di tale combinazione nell’ambito di un trattamento chemioterapico dei tumori pancreatici e costituiscono un sostegno alla validità dell’analisi farmacogenetica per stabilire la probabilità di efficacia della terapia in queste neoplasie.