Validation of the anti-chondrogenic properties of the microRNA-221 and Slug transcription factor by different in vitro and in vivo models: new perspectives for cartilage regeneration

Le lesioni della cartilagine dovute a traumi o patologie legate all’invecchiamento, in particolare artrosiche, rappresentano una delle principali cause di morbilità a livello mondiale, nonchè un gravoso onere economico per i sistemi sanitari nazionali. È ragionevole ipotizzare che l’aumento dell’aspettativa di vita determinerà un ulteriore incremento dell’incidenza di tali problematiche nel corso dei prossimi anni. Sfortunatamente, le poche terapie attualmente disponibili sono caratterizzate da un’efficacia limitata e/o un elevato tasso di fallimento. Da qui deriva la necessità e l’urgenza di sviluppare approcci innovativi in grado di arrestare e possibilmente revertire la degenerazione del tessuto cartilagineo, un processo che, una volta innescato, procede inesorabilmente verso uno stato infiammatorio cronico. Grazie alle recenti scoperte nel campo dell’ingegneria tissutale, della biologia cellulare e molecolare e dei biomateriali, la ricerca in questo campo sembra essere arrivata ad un punto di svolta. In particolare, le terapie basate sulle cellule stromali mesenchimali (hMSCs) suscitano attualmente forte interesse, in seguito ai notevoli risultati ottenuti dagli studi preclinici e dai trials clinici, e per l’innegabile potenziale terapeutico per la rigenerazione dei tessuti. Prima che questo obiettivo possa essere raggiunto, l’ostacolo principale che rimane da superare è probabilmente il controllo del differenziamento cellulare. Mentre infatti le hMSCs sono in grado di differenziare in senso condrogenico e produrre matrice cartilaginea, le condizioni ottimali in grado di determinare un fenotipo condrocitario stabile in vivo, come pure una produzione sufficiente di matrice, non sono note. Il progetto di ricerca in oggetto è stato principalmente rivolto all’ideazione di strategie innovative basate sull’utilizzo di hMSCs ingegnerizzate, in cui viene bloccata l’espressione di specifici regolatori anti-condrogenici, per stimolare il riparo della cartilagine. In tale contesto, l’utilizzo di tecnologie molecolari e analisi funzionali ha inoltre permesso di delucidare network cellulari che intervengono nella regolazione della condrogenesi, la conoscenza dei quali è il pre-requisito per lo sviluppo di approcci terapeutici più efficaci e mirati. Il lavoro si è principalmente focalizzato su due regolatori cellulari che solo recentemente sono stati proposti come fattori anti-condrogenici, il microRNA miR-221 e il fattore trascrizionale Slug. In una prima fase, gli esperimenti hanno dimostrato come l’inibizione di miR-221 o Slug mediante silenziamento genico sia sufficiente per differenziare in vitro hMSCs derivanti da diverse fonti in senso condrocitario, senza richiedere l’aggiunta di induttori convenzionali. Al fine di rafforzare la validità delle evidenze ottenute, sono stati quindi messi a punto ed impiegati specifici sistemi di coltura in 3D, come la combinazione delle hMSCs con scaffold biocompatibili (“scaffold-based tissue engineering”), sistemi di coltura in pellet o mediante aggregati cellulari (“scaffold-less aggregate tissue engineering”), e modelli osteocondrali in vitro. Va sottolineato come tali sistemi di coltura potranno essere sfruttati come piattaforme avanzate per testare il potentiale differenziativo e terapeutico di hMSCs ingegnerizzate, essendo più rappresentativi del microambiente osteocondrale in vivo. Al fine di conferire un valore traslazionale al progetto di tesi, è stato infine valutato e dimostrato come il silenziamento di miR221 possa effettivamente rappresentare una strategia perseguibile per differenziare le hMSCs in condrociti in vivo, e per incrementare la produzione di matrice cartilaginea nel contesto di un difetto osteocondrale. In conclusione, il lavoro di tesi ha permesso non solo di definire aspetti della regolazione della condrogenesi non ancora caratterizzati, ma anche di identificare nuovi target molecolari che possono essere opportunamente manipolati al fine di stabilizzare il fenotipo condrocitario delle hMSCs differenziate. Questo ci porta ad ipotizzare che approcci basati sulla manipolazione di fattori endogeni chiave, come quelli qui proposti, potranno essere impiegati per ottenere hMSCs dotate di un elevato potenziale differenziativo e terapeutico, gettando le basi per importanti applicazioni nel campo della medicina rigenerativa.