Generation of fluorescent reporter lines for hiPSCs derived midbrain dopaminergic neurons: using a CRISPR/Cas9 based knock-in approach to mark TH and GIRK2 expression in vitro

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerative progressiva caratterizzata da una perdita specifica di neuroni dopaminergici tipo A9 nell´area della substantia nigra pars compacta (SNpc). Lo sviluppo di cellule staminali pluripotenti derivate da pazienti (hiPSCs) e la loro efficiente conversione in neuroni dopaminergici ha stimolato la loro applicazione in modelli patologici e il loro utilizzo per lo screening e lo sviluppo di nuovi farmaci fino alla potenziale applicazione in medicina rigenerativa tramite trapianto di cellule precursori. hiPSCs differenziate in neuroni dopaminergici possono essere utilizzate anche per lo studio di patologie neurologiche in vitro. Tuttavia, gli attuali protocolli di differenziamento neuronale sono limitati nella possibilità di generare popolazioni omogenee di neuroni dopaminergici. Questo comporta una importante limitazione per questo sistema nel suo utilizzo come modello di patologia predittivo e applicazioni traslazionali nel PD. Per superare questa limitazione, nel mio lavoro di tesi di dottorato ho generato delle linee hiPSCs knock-in, in cui reporter fluorescenti sono stati introdotti in due loci distinti, la cui espressione è caratteristica durante il differenziamento in neuroni dopaminergici, nominalmente gene TH per tyrosine hydroxylase (TH) e gene KCNJ6 per G-protein activated inward rectifier potassium channel 2 (GIRK2). La presenza combinata di queste due proteine è un marcatore distintivo per i neuroni dopaminergici tipo A9, i più vulnerabili in PD. Per l´ingegnerizzazione genetica mediante CRISPR/Cas9, guide specifiche sgRNAs sono state disegnate per il targeting dei due differenti loci. Per ognuno dei due loci, un donor-template è stato disegnato allo scopo di ottenere l´integrazione dei due reporter fluorescenti in combinazione allo stop-codon dei due geni mediante uno specifico homologous directed repair (HDR). La strategia knock-in è stata disegnata in modo tale da rimpiazzare lo stop-codon di entrambi i geni con un frammento di circa 1500 bp contenente una sequenza per T2A peptide, una proteina fluorescente e una resistenza per un antibiotico con un promoter affiancato da loxP sites. Il T2A peptide permette il “taglio” della proteina fluorescente dalla proteina endogena evitando la formazione di una proteina di fusion. Un metodo specifico di screening basato su digital droplet PCR (ddPCR) è stato messo a punto e validato per l´identificazione manuale di cloni dove è avvenuta positivamente HDR. Questa ingegnerizzazione genetica permette l´identificazione di neuroni dopaminergici in vitro tramite l´espressione endogena del reporter fluorescente sotto il controllo dei geni TH e GIRK2. Questo lavoro rappresenta la base per lo sviluppo di un modello cellulare ingegnerizzato tale che potrà permettere varie applicazione tra cui il riconoscimento dei neuroni dopaminergici in vitro, la loro separazione tramite cell sorting con conseguente arricchimento della popolazione neuronale dopaminergica per diverse applicazioni di ricerca di base e per medicina rigenerativa.

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by a focal loss of class A9 dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc). The establishment of patient derived pluripotent stem cells (hiPSCs) and their efficient conversion into dopaminergic neurons fueled the possibilities for disease modelling and its implication in development and screening of novel drugs up to implementation of cell transplantation therapies. hiPSCs can be differentiated into dopaminergic neurons and support the study of neurological diseases in vitro. However, current neuronal differentiation protocols all lack the ability to produce a homogeneous population of midbrain DA neurons. This states an important limitation for the system as a predictive and translational application for in vitro disease model for PD. To overcome this limitation, I created knock-in hiPSCs that carry fluorescent reporter genes at two distinct loci, whose gene expression is characteristic of dedication to DA cell fate, which are TH gene for tyrosine hydroxylase (TH) and KCNJ6 gene for G-protein activated inward rectifier potassium channel 2 (GIRK2). The combined presence of these two proteins is marking the A9 subtype of DA neurons, most susceptible in PD. For CRISPR/Cas9 editing, specific sgRNAs were designed for targeting the two different loci. For both loci, a donor template was designed in order to be delivered at the target site and enable homologous directed repair (HDR) at the stop codon of two loci. A knock-in strategy was designed which implied replacing the stop codon of both loci with an approximately 1500bp fragment containing the sequence for a T2A peptide, a fluorescent protein and an antibiotic resistance cassette with a promoter flanked by loxP sites. The T2A peptide allows “cleavage” of the fluorescent protein from the endogenous gene, to ensure evading fusion protein formation. A specific digital droplet PCR (ddPCR) screening approach allowed the screening of HDR positive clones and subsequent manual selection. This engineering strategy allows the identification of DA neurons in vitro through an endogenously driven reporting system. The outcome of this work is the starting point for manifold applications, not last, because of the ability to recognize DA neurons with flow cytometry and enrich the population.