Basi molecolari dell’apprendimento: identificazione dei geni differenzialmente espressi nelle regioni medio-temporali del cervello di ratto in seguito a contextual fear conditioning

Durante il dottorato di ricerca ho condotto esperimenti finalizzati ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi nelle strutture cerebrali (quali ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) coinvolte in processi di apprendimento, in ratti sottoposti al paradigma comportamentale del contextual fear conditioning (CFC). Molte informazioni sulla memoria e sull’apprendimento associativo derivano da studi di condizionamento classico. Tale paradigma implica la formazione di un’associazione tra stimoli e/o risposte quando uno stimolo neutro chiamato stimolo condizionato (CS) è associato ad uno stimolo che normalmente evoca una risposta fisiologica chiamato stimolo incondizionato (US). Accoppiando ripetutamente i due stimoli anche il solo CS è in grado di generare la risposta. Una forma di condizionamento classico è il condizionamento alla paura o classical fear conditioning, basato su processi neurali di apprendimento e memoria che permettono di rispondere in maniera efficace a stimoli, che altrimenti non indurrebbero risposte spontanee di paura. In tale paradigma comportamentale l’amigdala svolge un ruolo chiave indipendentemente dalle modalità sensoriali usate come CS. Anche l’ambiente dove viene presentato l’US può assumere caratteristiche di CS inducendo risposte che vengono definite di paura condizionata al contesto. In questa forma di condizionamento al contesto si ha l’attivazione dell’amigdala, della corteccia peririnale e soprattutto dell’ippocampo. Animali sottoposti al CFC mostrano una risposta comportamentale alla paura che è quella dell’immobilità o freezing ogni volta che sono inseriti nell’apparato di condizionamento (retrieval test). Registrazione elettrofisiologiche effettuate su slices di ippocampo di ratti condizionati evidenziano la comparsa di modificazioni dell’eccitabilità che perdurano fino a 7 giorni dopo il condizionamento. Tali modificazioni sono correlate a processi neurali che avvengono solo in questi animali (associazione tra stimolo avversivo e contesto). E’ noto che forme di memoria a lungo termine sono associate a modificazione dell’espressione genica e sintesi di nuove proteine che sono alla base di cambiamenti strutturali persistenti. Per individuare i possibili geni coinvolti in tali modificazioni in seguito a CFC, ho utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive Hybridisation, SSH). L’SSH rappresenta un efficiente metodo di analisi dei trascritti portando alla costruzione di librerie sottrattive di cDNA e al successivo isolamento di sequenze differenzialmente espresse nei campioni in analisi. Il vantaggio dell’SSH consiste nella capacità di isolare anche i trascritti più rari non evidenziabili con altre tecniche che evidenziano pattern di espressione genica. A 48 ore di distanza dal CFC, i cervelli sia degli animali condizionati che dei naïve (animali mai entrati nell’apparato di condizionamento) sono stati estratti e sezionati in tre parti: anteriore, medio-temporale e cerebello-bulbare. Dalle regioni medio-temporali dei cervelli dei ratti di entrambi i gruppi sperimentali sono stati isolati gli mRNA poliA+ che poi sono stati utilizzati per la per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA. Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione delle librerie ottenute, i cDNA sono stati clonati e sottoposti a screening primario. In base ai segnali di ibridazione ottenuti, sono stati scelti 100 cloni come candidati ad essere differenzialmente espressi dopo il CFC. Le sequenze dei cloni candidati ad essere differenzialmente espresse sono state analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite programmi come BLAST e FASTA. L’analisi di espressione di questi trascritti è stata poi valutata con RT-PCR relativa o RT-PCR realtime. I geni modulati dal condizionamento contestuale alla paura sono risultati essere coinvolti nella modulazione sinaptica, nel turn-over proteico, nella apoptosi, nel segnale di trasduzione del segnale e nella attività mitocondriale.