VALUTAZIONE IN VITRO DELL’ATTIVITA’ ANTITUMORALE DI ESTRATTI LIPOFILI, LORO FRAZIONI E COMPOSTI PURI DERIVANTI DALLE TRE SPECIE MEDICINALI DI ECHINACEA

L’Echinacea è una pianta erbacea perenne appartenente alla famiglia delle Asteraceae. Se ne conoscono nove specie di cui solo tre sono utilizzate in ambito fitoterapico, E. purpurea (L.) Moench, E. angustifolia (DC.) Hell. ed E. pallida (Nutt.) Nutt. I principi attivi presenti nelle specie medicinali di Echinacea appartengono a diverse classi di composti, in particolare, vi si ritrovano polifenoli, tra cui derivati dell’acido caffeico, polisaccaridi, di cui i principali sono gli arabinogalattani, e composti di natura lipofila, in particolare derivati alchilammidici e acetilenici. Le principali attività farmacologiche riconosciute a questa pianta sono: l’azione antinfiammatoria, immunomodulatoria, antiossidante, e cicatrizzante (1). Le preparazioni a base di Echinacea sono tra i rimedi fitoterapici più venduti nel mercato Europeo e Statunitense (2), e il loro uso è diventato molto popolare tra i pazienti neoplastici, principalmente per l’attivitá immunostimolante riconosciuta alla pianta (3) di cui sembrano essere responsabili i polisacccardi ad alto peso molecolare (arabinogalattani) e le alchilammidi (4). A queste ultime, recentemente, è stata dedicata attenzione, riconoscendogli anche un' attività cannabimimetica (5,6) ed una buona biodisponibilità quando somministrate per os all'uomo (7). Negli ultimi anni, composti cannabinoidi naturali e di sintesi hanno mostrato buona capacità antiproliferativa su diversi tumori, sia in studi in vitro che in vivo (8). Il lavoro di questo dottorato di ricerca è stato rivolto, quindi, alla valutazione della potenziale attività antitumorale in vitro degli estratti lipofili di radici delle tre specie medicinali di Echinacea, analizzando, successivamente, attraverso un proceso bio-guidato, anche frazioni e composti puri da essi derivanti. Nella prima parte della ricerca è stata valutata l’attività degli estratti sulla proliferazione di due linee cellulari tumorali umane, MIA PaCa-2, di pancreas e COLO320, di colon. L'influenza sulla vitalità cellulare è stata studiata utilizzando il saggio colorimetrico WST-1 (Roche, Mannheim) e i risultati espressi in % rispetto alla vitalità di cellule trattate con il solo solvente. I risultati ottenuti hanno evidenziato un effetto antiproliferativo di tutti gli estratti in esame, con maggiore attività da parte di quello derivante dalla specie E. pallida che mostrava un effetto sia tempo (4-72 ore di esposizione) che dose-dipendente (30-300 µg/mL). Il trattamento delle cellule con tale estratto determinava un significativo incremento dell’attivitá delle caspasi 3/7 (saggio enzimatico, Promega, Milano) e della presenza di frammenti internucleosomici di DNA a livello citoplasmatico (saggio ELISA, Roche, Mannheim), suggerendo un coinvolgimento del processo apoptotico (9). La diversa intensitá dell’effetto antiproliferativo della specie E. pallida rispetto alle altre due, poteva essere ascritto alla differente composizione fitochimica, dato che l’estratto esanico di radice di questa specie è ricco in composti polienici e poliacetilenici, mentre manca dei derivati alchilammidici, componenti principali, invece, della altre due specie di Echincea (10). Nella seconda parte del progetto, dunque, l’attenzione è stata focalizzata sulla specie E. pallida, con l’obiettivo di testare frazioni e composti puri derivati dal frazionamento bioguidato dell’estratto esanico. Sui composti puri è stato anche effettuato un saggio per valutarne la potenziale biodisponibilitá orale, attraverso la metodica in vitro del monostrato di cellule Caco-2, modello riconosciuto di permeabilità intestinale (11). Tutti gli acetileni saggiati (composti 1-5) hanno mostrato un effetto antiproliferativo concentrazione- (0.1-100 μM) e tempo- (24-72 ore di esposizione) dipendente su entrambe le linee cellulari, con un maggiore effetto inibitorio sulla vitalità della linea di colon. Il composto 5 ha evidenziato, inoltre, una maggiore attivitá citotossica rispetto agli altri composti. Da un'analisi computazionale delle strutture chimiche, questo acetilene è risultato avere un più alto rapporto superficie non polare/superficie polare rispetto alle altre molecole, proprietà che potrebbe essere alla base della sua maggiore attività. Dall’analisi della biodisponibilitá è risultato che alcuni acetileni presenti nell’estratto (tra cui il composto 5) sono in grado di attraversare il monostrato cellulare di Caco-2 rapidamente e con una buona permeabilitá apparente, suggerendo cosí una probabile buona biodisponibilitá per assunzione orale (12). L’ultima parte del progetto si è focalizzata sul composto piú attivo, la cui attivitá antiproliferativa è stata confermata utilizzando altre due linee cellulari tumorali umane, la HL-60, leucemica e la MCF-7, di carcinoma mammario, con risultati paragonabili a quelli ottenuti sulla linea MIA PaCa-2 (per HL-60) e sulla linea COLO320 (per MCF-7). E’ stata quindi eseguita un’analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare dopo trattamento con il composto in esame, i cui risultati hanno dimostrato un incremento della popolazione cellulare in fase G0/G1. Ulteriori esperimenti potranno consentire di verificare il ruolo di specifici mediatori intracellulari nella risposta a questo composto. BIBLIOGRAFIA: 1. Speroni E. et al. (2002) J Ethnopharmacol: 265-72 2. Chen Y. et al. (2005) J Nat Prod: 773-6 3. Richardson M.A. et al. (2000) J Clin Oncol: 2505-14 4. Miller S.C. (2005) Evid Based Complement Alternat Med: 309-314 5. Gertsch J. et al.(2004) FEBS Letter: 563-569 6. Raduner S. et al. (2006) J Biol Chem: 14192-14206 7. Matthias A. et al. (2005) Molecules: 1242-1251 8. Sarfaraz S. et al. (2008) Cancer Res: 339-342 9. Chicca A. et al. (2007) J Ethnopharmacol: 148-53 10. Barnes J. et al. (2005) J Pharm Pharmacol: 929-54 11. Matthias A. et al. (2004) J Clin Pharm Ther: 7-13 12. Chicca A. et al. (2008) Br J Pharmacol: in press