ANALISI ULTRASTRUTTURALE DEGLI EFFETTI DELLA RAPAMICINA IN CELLULE DI GLIOBLASTOMA UMANO (U87MG)

I gliomi sono neoplasie che originano dalle cellule gliali (astrociti) e, tra i tumori primitivi dell’encefalo, sono le forme più frequenti. Tra questi il glioblastoma (GB, astrocitoma di grado IV) è la forma più aggressiva, caratterizzata da molteplici alterazioni molecolari, particolare tendenza all’invasione ed elevata resistenza a chemioterapia e radioterapia. Dal punto di vista istologico il GB è costituito da una popolazione eterogenea di cellule tumorali scarsamente differenziate e presenta regioni dense di focolai necrotici “a pseudo-palizzata”. Inoltre mostra intensa proliferazione microvascolare e infiltrazione nei tessuti circostanti, entrambe sostenute dalla presenza di nicchie contenenti cellule staminali/progenitrici del GB (GSPCs). A livello molecolare, recidiva e infiltrazione sono correlati con l’incremento del complesso molecolare mTOR (mammalian Target Of Rapamycin), dotato di attività chinasica che controlla la vitalità cellulare. In particolare, mTOR agisce da modulatore negativo dell’autofagia, la principale via di rimozione di macromolecole ed organelli danneggiati, la cui alterazione è alla base di molte malattie. Sebbene sia noto da tempo che la rapamicina e i suoi analoghi strutturali agiscono come potenti inibitori di mTOR, non vi sono studi definitivi riguardanti il loro effetto sul GB. Alla luce di questi dati, nel presente studio si è valutato l’effetto indotto da varie dosi di rapamicina in un modello sperimentale in vitro di GB, utilizzando una linea cellulare di glioma umano (U87MG). A queste cellule è stata somministrata rapamicina a varie concentrazioni, da 1 nM fino a 1 μM, per un tempo di esposizione di 24 ore. I risultati ottenuti in seguito a conta cellulare diretta in microscopia ottica hanno dimostrato che la rapamicina esercita un effetto antiproliferativo dose-dipendente. In particolare, il trattamento con basse dosi (1 nM) non ha effetto sulla vitalità cellulare, la quale è invece significativamente ridotta per dosi più elevate (10 nM, 100 nM e 1 μM). Quindi è stata effettuata un’indagine ultrastrutturale in microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che rappresenta il gold standard nello studio dell’autofagia. In particolare sono stati analizzati i correlati ultrastrutturali dell’inibizione della via autofagica nelle cellule U87MG attraverso l’analisi dei vacuoli ATG-like e dei vacuoli LC3 positivi. I risultati hanno dimostrato che la rapamicina agisce in modo dosedipendente stimolando la via autofagica e inducendo la formazione di vacuoli autofagici. Tale effetto si accompagna allo switch fenotipico delle cellule U87MG, osservabile a partire già da dosi basse di rapamicina. I risultati hanno dimostrato infatti che il trattamento con rapamicina riduce il numero di particelle di immunogold per l’antigene di staminalità nestina ed aumenta il numero di particelle di immunogold per l’antigene neuronale precoce βIII-tubulina. Inoltre, l’analisi ultrastrutturale dei mitocondri in seguito a trattamento con rapamicina ha evidenziato un progressivo aumento del numero dei mitocondri ed una preservazione della morfologia e dell’architettura mitocondriale. Questi risultati sono stati confermati da studi preliminari, in corso di completamento, in un modello in vivo di GB. In questo modello basse dosi di rapamicina inducono una marcata riduzione dell’immunopositività per l’antigene di staminalità nestina ed un aumento dell’immunopositività per l’antigene neuronale precoce βIII-tubulina. I dati presentati in questo lavoro di tesi confermano il ruolo centrale di mTOR e dell’autofagia come fattori determinanti dello sviluppo e della progressione del glioblastoma e forniscono la prima prova ultrastrutturale della modulazione dell’autofagia in questo tumore cerebrale.