Nuove tecniche di valutazione dell'attività riproduttiva di femmine di pitone reale (Python regius) mantenute in cattività

The Royal python (Python regius) is one of the non-conventional species most commonly bred in captivity. To have healthy, well-acclimated, captive-bred snakes an accurate monitoring of the reproductive activity is necessary. As for most of exotic species, also for reptiles it is important to use non-invasive monitoring methods, in order to have repeated evaluations minimizing the animal stress. Ultrasonography has been successfully used to evaluate reproduction in many reptile species, such as tortoises, lizards and some snakes. Ultrasound allows the visualization of follicles, embryonic structures and viability. Non-invasive hormonal monitoring using urine or feces has also been applied with good results in a variety of animal species. However, little is known on the Royal python reproductive activity, and there are no studies evaluating the hormonal aspect in this species. The aim of the present study is to monitor the female reproductive cycle of Royal python using ultrasonography and gonadal steroid metabolite measurement in feces. 129 adult female P. regius were examined at one-week intervals during two reproductive cycles (2015-2016). All the animals were captive born and individually housed in rack, at temperature of 28-31°C under a 12:12 h L/D cycle. We performed brief (5 min) scans on non-anaesthetized P. Regius using a portable ultrasound system and a 10-12 MHz linear array transducer (MyLab™ 30 Gold, Esaote). The position, ultrasound features, dimension and echogenicity of the reproductive structures were determined. During the second reproductive cycle, 30 animals have been also evaluated in relation to the hormonal profile, with monthly collection of faecal samples. These samples were classified according to reproductive stage, and mean fecal Progesterone and 17β-Estradiol levels were calculated using results obtained by assaying these samples (by enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). Follicles in different stages of development were located laterally on both sides within the caudal half of the body in all female samples. Follicles and eggs in various stages of development, follicles undergoing regression were observed. On the basis of the sonographic appearance and size of follicles and eggs, we have divided the reproductive cycle in four phases: anovulatory phase, transition, folliculogenesis and embryogenesis. The folliculogenesis ends with ovulation, and thus indicates the correct time for entering the male. Progesterone showed an upward trend from the anovulatory phase to embryogenesis. Estradiol instead showed greater variability, with higher levels during the anovulatory phase and transition, compared to the later stages of the cycle. Ultrasonography has been widely used as a rapid and non-invasive method for image soft tissues of the coelomic cavity in reptiles. Because of interspecific variability, it is important to consider individually the different species. The present study suggests that by ultrasound it is possible to clearly identify different phases in the Royal python female reproductive cycle. It is a definitely important technique in the context of a professional breeding, to precisely detect the folliculogenesis phase and thus to highlight the right time to introduce the male. This technique is also useful to identify the females with follicular regression or slugs producing. Furthermore gonadal steroid metabolite measurement in feces, especially the evaluation of progesterone, could be an important help to integrate the reproductive information regarding a specific female. In conclusion, our study suggests that the association of ultrasonography and the sexual steroid metabolite measurement in feces gives an accurate picture of ovarian activity in captive adult female Royal python.

Il pitone reale (Python regius) è una delle specie esotiche più comunemente allevate. Come per altri animali non convenzionali, anche per il monitoraggio riproduttivo dei rettili è importante utilizzare tecniche non invasive, per poter eseguire valutazioni ripetute minimizzando lo stress provocato agli esemplari. L'ultrasonografia è stata impiegata con successo per diverse specie, quali tartarughe, lucertole ed alcuni serpenti. Tale tecnica permette la valutazione di follicoli, uova e vescicole embrionali. Anche il monitoraggio ormonale non invasivo mediante urina o feci è stato impiegato con buoni risultati in diversi casi. In letteratura è ancora scarso il contributo per quanto riguarda l’attività riproduttiva del pitone reale e ad oggi non sono riportate ricerche relative alla valutazione degli ormoni sessuali in questa specie. Lo scopo del presente studio è quello di monitorare il ciclo riproduttivo femminile di pitone reale, utilizzando l'ecografia e la misurazione non invasiva dei metaboliti fecali degli steroidi sessuali. 129 femmine adulte sono state esaminate ecograficamente con frequenza settimanale durante due cicli riproduttivi successivi (2015-2016). Sono stati considerati animali nati in cattività e stabulati singolarmente in rack, ad una temperatura di 28-31 °C con ciclo 12:12 h L/D. Sono state eseguite brevi scansioni (5 min) sulle femmine non sedate, utilizzando un ecografo portatile ed una sonda lineare settata a 10-12 MHz (MyLabTM 30 Gold, Esaote). Sono state valutate le strutture riproduttive in termini di posizione, caratteristiche ecografiche e dimensioni. Durante il secondo ciclo riproduttivo 30 animali sono stati ulteriormente valutati in relazione al profilo ormonale con raccolta mensile di campioni fecali. Sono stati valutati i livelli medi di progesterone e 17β-estradiolo, attraverso l’analisi dei singoli campioni (con metodica immunoenzimatica, ELISA). I follicoli sono stati individuati su entrambi i lati, nel terzo medio e caudale del corpo per tutti gli esemplari valutati. Sono in particolare stati osservati follicoli in diverso stadio di sviluppo, uova con vario grado di calcificazione e follicoli in fase di regressione. In base all’aspetto ecografico nonché alle dimensioni di follicoli e uova, il ciclo riproduttivo è stato suddiviso in quattro fasi successive: fase anovulatoria, fase di transizione, follicologenesi ed embriogenesi. Durante la follicologenesi avviene l'ovulazione, tale fase indica dunque il momento corretto per l'inserimento del maschio. Il progesterone ha mostrato livelli crescenti dalla fase anovulatoria verso quella di embriogenesi. Il 17β-estradiolo ha invece presentato livelli più elevati durante le fasi anovulatoria e di transizione, rispetto alle fasi seguenti. L’ultrasonografia è stata ampiamente impiegata come metodo rapido e non invasivo per valutare i tessuti molli della cavità celomatica nei rettili. Data la variabilità interspecifica, è importante considerare singolarmente le diverse specie. Il presente studio suggerisce che mediante l'ecografia sia possibile identificare chiaramente diverse fasi del ciclo riproduttivo femminile del Pitone reale. Si tratta di una tecnica decisamente importante nel contesto di un allevamento professionale, permette infatti di rilevare con precisione la follicologenesi e dunque il momento corretto per introdurre il maschio. Consente di identificare le femmine che mostrano regressione follicolare o uova non fertili. Inoltre, la valutazione dei metaboliti fecali degli steroidi sessuali, ed in particolare in relazione ai livelli di progesterone, si è rivelata essere un’utile tecnica per integrare le informazioni riguardanti l’attività riproduttiva. In conclusione, il presente studio suggerisce che l'associazione di ultrasonografia e dosaggio dei metaboliti fecali degli steroidi sessuali, possa fornire un quadro preciso dell'attività riproduttiva delle femmine di pitone reale allevate in cattività.