The Notch pathway in osteogenic differentiation: an In vitrio study

Sebbene la maggior parte dei difetti ossei possa guarire spontaneamente, tuttavia in clinica i ritardi di consolidazione ossea, così come le condizioni in cui la perdita di tessuto osseo è eccessiva in seguito a traumi o tumori maligni rappresentano ancora una sfida importante per i chirurghi ortopedici. Metodi terapeutici basati sull’utilizzo di cellule staminali mesenchimali (MSC) e la stimolazione del loro differenziamento verso la linea osteoblastica sono ampiamente studiati per la riparazione delle lesioni ossee in tali condizioni cliniche. Il differenziamento osteogenico è un processo complesso che coinvolge diverse vie di trasduzione del segnale, che comprendono la via di Notch, una via altamente conservata che sembra essere essenziale per il corretto sviluppo scheletrico e il rinnovamento delle ossa. Nonostante i numerosi studi in vivo e in vitro relativi alla via di Notch durante la formazione delle ossa ed il differenziamento osteogenico, ancora diversi risultati contrastanti sono presenti in letteratura, poiché sono stati riportati sia effetti inibitori e stimolatori. Inoltre, la maggior parte degli studi precedenti in vitro hanno studiato il ruolo della via di Notch, attraverso l’induzione della overespressione o della inattivazione di specifici componenti appartenenti alla via di trasduzione o analizzando il suo potenziale coinvolgimento solo durante un breve periodo rispetto all’intero periodo di differenziamento. In base a quanto esposto, lo scopo di questo studio è stato chiarire il ruolo del segnale di Notch durante il differenziamento di cellule staminali mesenchimali umane indotto in vitro, in assenza di manipolazione genetica delle cellule. A tale scopo, abbiamo indotto il differenziamento osteogenico di cellule staminali mesenchimali e verificato il processo differenziativo tramite l'analisi dei tipici marcatori osteogenici precoci e tardivi (ALP, Osteocalcina e mineralizzazione), e della espressione genica dei principali fattori di trascrizione osteogenici (Runx2, Osterix e Dlx5). Possibili variazioni nella espressione di componenti appartenenti alla via di segnalazione Notch comprendenti i recettori, i ligandi ed i geni nucleari, sono state analizzate e correlate ad i principali eventi differenziativi durante tutto il periodo di differenziamento cellulare in coltura (28 giorni). Inoltre, abbiamo valutato gli effetti della inibizione della via di Notch sul differenziamento per confermare il potenziale coinvolgimento della via. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la via di Notch è coinvolta nel favorire il processo di differenziamento osteogenico ed hanno suggerito che i geni nucleari target della via di Notch, Hes5 e Hes1 siano coinvolti, a seguito dell'attivazione dal recettore Notch4. Inoltre è stato osservato un significativo aumento dell'espressione di Hey1, un altro gene bersaglio della via di Notch, in tempi specifici del differenziamento, che appare quindi come un altro importante gene coinvolto nel differenziamento osteogenico, sebbene i dati suggeriscano che la sua espressione sia regolata da un’altra via di segnalazione cellulare. Infatti, in accordo con la complessità delle vie di trasduzione del segnale implicate nel differenziamento osteogenico, i nostri risultati confermano che altre vie di segnalazione sono coinvolte, come suggerito dallo shift temporale nell’aumento di espressione dei tipici fattori di trascrizione osteogenica e dei geni nucleari della via di Notch, così come dall’aumentata espressione di Hey1, indipendentemente dalla via di Notch, come dimostrato dall’utilizzo di inibitori specifici della via di segnlazione. Inoltre, per la prima volta in questo studio dimostriamo che gli effetti dei campi elettromagnetici pulsati (CEMP), che rappresentano un noto stimolo biofisico coinvolto nel favorire il differenziamento osteogenico e la guarigione ossea, possono essere associati alla modulazione della via di Notch e all’aumento della espressione del gene nucleare Hey1. Questi risultati forniscono importanti nuove informazioni riguardanti i meccanismi molecolari attraverso i quali i CEMP possono modulare l'osteogenesi. Complessivamente i risultati di questo studio chiariscono il ruolo della via di Notch nel differenziamento osteogenico indicando che tale via è in grado di stimolare tale processo differenziativo di cellule staminali mesenchimali umane. Tali risultati possono essere rilevanti anche dal punto di vista clinico per la ottimizzazione dei trattamenti terapeutici e degli approcci di ingegneria tissutale per la riparazione ossea.