Pharmacological characterization of novel ligands acting as NOP/opioid receptor agonists

La famiglia dei recettori oppioidi comprende i classici recettori oppioidi, mu (MOP), delta (DOP) e kappa (KOP) ed un quarto membro, chiamato recettore NOP, identificato come il recettore del peptide endogeno nocicettina/orfanina FQ (N/OFQ). Proprio per la sua distinta farmacologia, il recettore NOP è indicato come un ramo non oppioide della famiglia dei recettori oppioidi. Nonostante l’uso di farmaci oppiacei come morfina o fentanil, selettivi principalmente per il recettore MOP, sia associato a diversi effetti collaterali, tra cui la depressione respiratoria, stipsi, la tolleranza e la responsabilità abusi, tutt’oggi i farmaci oppioidi rimangono i più potenti analgesici a disposizione per alleviare il dolore. Inoltre, mentre gli effetti degli oppioidi in un modello di dolore nocicettivo acuto sono considerati brillanti, la loro efficacia in pazienti con dolore cronico, in particolare di tipo neuropatico, diviene spesso deludente. Fatte queste considerazioni, appare ovvia la necessità medica di individuare nuovi farmaci per il trattamento di malattie croniche (soprattutto neuropatiche). Il sistema recettoriale N/OFQ-NOP è coinvolto nella modulazione di diverse funzioni biologiche tra cui la trasmissione del dolore. Recenti evidenze ottenute in modelli animali di dolore sia in roditori che in primati non umani hanno dimostrato che la simultanea attivazione di entrambi i recettori NOP e MOP è in grado di suscitare effetti analgesici con sinergia di potenziamento. Su queste basi, ligandi agonisti misti NOP/MOP sembrano degni di essere sviluppati come innovativi farmaci analgesici. Lo scopo del presente studio è stato quindi la caratterizzazione farmacologica di nuovi ligandi progettati per agire come agonisti misti dei recettori oppioidi/NOP. Questi composti sono stati progettati, sintetizzati e purificati presso il Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche del nostro Ateneo dai gruppi di ricerca di Claudio Trapella e Remo Guerrini. Agonisti misti MOP/NOP sono stati generati per mezzo di strategie chimiche complementari utilizzando un unico farmacoforo non selettivo o due distinti farmacofori ciascun selettivo per il recettore NOP o MOP, legati tra loro per mezzo di un apposito spacer chimico in modo da creare composti chimerici. Questi approcci chimici sono stati applicati a molecole sia di tipo peptidico che non peptidico generando i seguenti ligandi misti NOP/MOP: PWT2-[Dmt1] e cebranopadol tra i composti non selettivi, mentre Deno e RR4-Ro come composti chimerici. I profili farmacologici di queste molecole sono stati analizzati in vitro in diversi saggi, tra cui binding recettoriale, stimolazione del [35S] GTPγS, formazione di AMP ciclico, Western Blotting e rilevamento di attività MAPKinase, studi di mobilizzazione del calcio eseguiti in cellule coesprimenti i recettori ricombinanti umani e proteine-G chimeriche, saggio di trasferimento di energia bioluminescente per risonanza (BRET) volto ad indagare l'interazione del recettore con proteine G e/o β-arrestina 2, e in saggi biologici in tessuti isolati. Inoltre gli effetti di DeNo sono stati valutati anche in vivo nel paw pressure test in ratti, mentre quelli del cebranopadol in esperimenti di tail withdrawal and formalin tests in topi. La recente tecnologia PWT è stata applicata al noto agonista universale oppioide [Dmt1]N/OFQ(1-13)NH2, permettendoci di ottenere con una facile sintesi il rispettivo derivato tetramerico. PWT-[Dmt1] mostra in vitro la stessa attività farmacologica, potenza e selettività di azione del peptide d’origine, mentre sono in corso studi per valutarne gli effetti in vivo dopo somministrazione spinale in primati non umani. Sarà particolarmente interessante misurare anche la durata d’azione del composto, considerando che precedenti studi condotti con varie sequenze peptidiche hanno dimostrato che questo parametro farmacologico risulta notevolmente incrementato dall’ applicazione della tecnologia PWT. La molecola peptidica Deno è stata sintetizzata collegando l'agonista selettivo MOP dermorfina con N/OFQ, agonista selettivo NOP. Deno imita gli effetti della dermorfina in preparati che esprimono il recettore MOP e le azioni della N/OFQ in preparazioni che esprimono i recettori NOP. Nell’ ileo di cavia, una preparazione farmacologica dove entrambi i recettori MOP e NOP sono espressi, l'attività biologica del composto è stata chiaramente antagonizzata da un cocktail di antagonisti selettivi MOP e NOP. Tuttavia, nonostante la sua attività MOP/NOP agonista in vitro, Deno mostra solo deboli proprietà antinocicettive in vivo dopo somministrazione spinale nei ratti. Cebranopadol si comporta come agonista universale del recettore NOP e oppioidi in studi di mobilizzazione del calcio e risultati simili sono stati ottenuti nel saggio BRET, dove cebranopadol agisce da potente agonista pieno per i recettori NOP e MOP. Interessante notare che cebranopadol esibisce bassa potenza nella promozione di interazioni MOP/βarrestina 2 e nessuna efficacia verso NOP/β-arrestina 2; agendo così come agonista parziale bias per la proteina-G in particolare a livello del recettore NOP. Valutare gli effetti farmacologici del cebranopadol nei tessuti è stata resa difficile da una sua bassissima cinetica d’ azione. In vivo cebranopadol è stato in grado di produrre effetti analgesici potenti e duraturi causati della contemporanea attivazione dei recettori NOP e MOP. È importante sottolineare che, contrariamente ai farmaci oppioidi, la potenza analgesica di cebranopadol è maggiore in modelli animali di infiammazione del dolore nocicettivo. Infine composti chimerici non peptidici sono stati generati legando l'agonista NOP Ro 656570 con derivati del fentanil della serie RR. Una lunga serie di esperimenti, tra i quali di binding, mobilizzazione del calcio e saggi biologici sono stati eseguiti per caratterizzare gli effetti farmacologici delle molecole standard (Ro 65-6570 e fentanil) e dei composti della serie RR. Da questi studi i composti RR4 e RR9 sono stati selezionati i migliori della serie. Purtroppo la chimica necessaria al legame di tali molecole a Ro 65-6570 si è dimostrata molto impegnativa, permettendo di ottenere solo una piccola quantità del composto chimerico RR4-Ro. Nel saggio di stimolazione del [35S]GTPγS, RR4-Ro mostra potenza ed efficacia simile a Ro 65-6570 in cellule esprimenti il recettore NOP e simile potenza associata ad una ridotta efficacia rispetto al fentanil in cellule MOP, fungendo così da misto agonista pieno NOP/agonista parziale MOP. In conclusione, il presente studio ha esaminato in dettaglio il profilo farmacologico di diverse molecole progettate per agire come agonisti misti dei recettori NOP/oppioidi fornendo così alla comunità scientifica nuovi strumenti utili nello studio del potenziale terapeutico di questa classe di composti come innovativi analgesici.