Study of an alternative gene embedded in the West Nile virus genome

RIASSUNTO L'analisi bioinformatica del genoma del virus West Nile (WNV) ha individuato 6 schemi di lettura alternativi, il più lungo dei quali (444bp), denominato WARF4, è presente solamente nei ceppi di WNV appartenenti alla linea virale I. Il gene alternativo è sovrapposto all’estremità 3' del gene NS4B ed in parte alla regione 5’ del gene dell’NS5. L'utilizzo di WARF4 è stato indirettamente dimostrato mediante l'individuazione di anticorpi specifici in sieri equini positivi al WNV. Poiché la sequenza di WARF4 è integrata nel gene della proteina virale NS4B, la nuova proteina è stata rinominata N-NS4B/WARF4. Lo scopo di questo progetto è dimostrare la produzione di N-NS4B/WARF4 in colture cellulari eucariotiche infettate con il virus West Nile. A tal fine abbiamo prodotto una una proteina ricombinante che include l'intera sequenza dello schema di lettura alternativo. Questa proteina è stata utilizzata come immunogeno per la produzione di un anticorpo monoclonale anti-WARF4, chiamato MAb 3A12. E' stata inoltre prodotta una proteina ricombinante che comprende la sequenza COOH terminale del gene NS4B da utilizzare come controllo nei test di validazione dell' anticorpo. MAb 3A12, è stato dapprima utilizzato in saggi immunoenzimatici che hanno confermato la sua specificità: in particolare è stata individuata la regione della proteina riconosciuta dall’anticorpo osservando la sua reattività in western blot con quattro peptidi sintetici che coprono tutta la sequenza aminoacidica codificata da WARF4. L’anticorpo MAb 3A12 ha riconosciuto la nuova proteina in cellule VERO infettate con il WNV appartenente alla linea virale I sia in esperimenti di immunofluorescenza che in western blot , mentre non ha reagito con cellule infettate con la linea virale II del virus. I risultati di analisi in western blot eseguite su lisato di cellule VERO infettate a tempi diversi dimostrano che N-NS4B/WARF4 viene espressa in quantità maggiore nella tarda fase dell’infezione. L’espressione “in vivo” della proteina N-NS4B/WARF4 è stata dimostrata indirettamente, sebbene su un numero limitato di campioni, valutando la sua immunogenicità in individui infettati con il WNV. Al momento non ci sono informazioni sperimentali circa il meccanismo di traduzione della proteina N-NS4B/WARF4, tuttavia si può supporre che la proteina venga prodotta in seguito ad uno scivolamento del ribosoma in posizione -1 durante la traduzione della poliproteina virale. Questo meccanismo di traduzione è già stato descritto per il West Nile ed è promosso da specifiche sequenze dell’RNA (slippery sequences associate a pseudoknot) rilevate dalle analisi bioinformatiche effettuate sui genomi virali analizzati. Come suggeriscono anche i dati ottenuti in western blot, in seguito allo scivolamento del ribosoma in posizione -1 la proteina codificata da WARF4 verrebbe sintetizzata come variante carbossi-terminale dell’antigene virale NS4B. Il possibile ruolo della proteina N-NS4B/WARF4 nel corso dell’infezione da WNV resta tuttora sconosciuto, tuttavia recenti dati di letteratura sembrerebbero suggerire un ruolo nella regolazione traduzionale del genoma virale. ABSTRACT Bioinformatics analysis performed on West Nile virus (WNV) genome revealed the presence of six alternative open reading frames, one of which, entitled WARF4, is the longest (444 bp) and exclusively restricted to the viral lineage I. The alternative gene is overlapping the COOH-terminal region of the NS4B gene and a small N-terminal portion of the NS5 gene. Since WARF4 is embedded in the NS4B gene, we rename the novel protein N-NS4B/WARF4. We previously reported that N-NS4B/WARF4 is able to elicit antibodies in WNV infected horses; however, there was no direct experimental proof of the existence of this novel protein. The purpose of this study was to demonstrate the in vitro production of WARF4 protein following WNV infection of mammalian cultured cells. For this purpose we produced two recombinant proteins : His- WARF4, that was used as immunogen for the production of a monoclonal antibody (MAb 3A12), and a NS4B carboxy - terminal portion protein as negative control for the evaluation of the antibody specificity. MAb 3A12 specificity to alternative protein was confirmed by its reactivity to only one peptide among four analyzed that cover the full WARF4 amino acids sequence. This antibody detected the novel protein in WNV lineage I-infected, cultured VERO cells while it did not react with WNV lineage II infected cells. In addition, WARF4 protein was expressed in the late phase of WNV lineage I infection. We indirectly demonstrated the “in vivo” production of N-NS4B/WARF4 by showing its immunoreactivity with human sera obtained from WNV infected patients. We have no experimental information on N-NS4B/WARF4 protein translation, but it appears reasonable to assume that a -1 ribosomal frameshifting mechanism produces the novel protein. This translation mechanism has already been described for West Nile. Since the proposed model requires the presence of specific RNA structures such as slippery sequences associated with pseudknot was carried out bioinformatics analysis that revealed these structures within the NS4B coding region. The data obtained in western blot assays suggest that following the ribosomal frameshifting in - 1 frame N-NS4B/WARF4 would be synthesized as carboxy-terminal variant of NS4B antigen. The possible role of the protein N-NS4B/WARF4 during WNV infection is still unknown, however recent literature data seem to suggest a possible role in the translational regulation of the viral genome.