Biochemical characterization of human kynurenine aminotransferase II (hKAT II): a drug target for cognitive diseases

Kynurenine aminotransferase (KAT) is a pyridoxal 5’-phosphate dependent enzyme, which catalyzes the irreversible transamination of L-kynurenine (KYN) to produce kynurenic acid (KYNA). KYN is the central metabolite in the Kynurenine pathway (KP), the main tryptophan degradation pathway in most living organisms. The scientific interest in KP is unceasing because some of its enzymes and metabolites (kynurenines) mediate relevant physiological functions and associated pathological states of the immune and nervous systems. In particular, KYNA is a neuroinhibitory metabolite of the KP, acting as a broad-spectrum endogenous antagonist of ionotropic excitatory amino acid receptors and a7 nicotinic acetylcholine receptors, which are involved in cognitive functions like learning and memory. Since these antagonistic effects are seen at KYNA concentrations found in the mammalian brain, elevations in the brain KYNA has been hypothesized as an important factor contributing to the pathogenesis and progression of neurological or psychiatric diseases that are associated to cognitive impairment, including schizophrenia and Alzheimer’s disease. In human and rodent brains four proteins named KAT I, II, III and IV, have been reported to be involved in KYNA synthesis. In view of its biochemical properties, KAT II is the prevalent isoform responsible for KYN degradation in mammalian brain to give KYNA. Therefore, human KAT II is a potential drug target in the treatment of neurophatological conditions characterized by a glutamatergic and cholinergic hypofunction related to an excess of KYNA, like Schizophrenia and Alzheimer’s disease. Despite hKAT II is considered a potential regulatory target for maintaining physiological concentrations of KYNA, a thorough biochemical characterization of this enzyme is still missing. The principal aim of this study was a detailed assessment of hKAT II in regards its biochemical and functional characteristics. In particular, the activity of hKAT II towards the natural substrates kynurenine and a-aminoadipate, and the inhibitors (R)-2-amino-4-(4-(ethylsulfonyl)-4-oxobutanoic acid and sulfinic acid was investigated. Moreover, we determined for the first time the intrinsic b-lytic activity towards the substrate analog b-chloroalanine of hKAT II and a variant carrying the Y142F mutation, expected, on the basis of structural evaluations, to exhibit a decreased propensity for b-elimination, a side reaction common to transaminases. The biochemical investigation has allowed us to develop two efficient and rapid assays to screen hKAT II inhibitors: i) a continuous assay based on the absorbance of the natural substrate L-KYN, that allows fast measurement of enzyme activity and determination of inhibition mechanisms; and ii) a 96-well plate suited, end-point assay based on the coupling of hKAT II activity to two reporter reactions. These assays are of interest in the high-throughput screening for specific hKAT II inhibitors. The availability of these assays and a detailed spectroscopic analysis allowed to demonstrate that (R)-2-amino-4-(4-(ethylsulfonyl)-4-oxobutanoic acid and sulfinic acid, reported to be selective and potent rat KAT II inhibitors, are actually substrate for the human ortholog, rather than pure competitive inhibitors. As a part of the activities carried out during the thesis, we carried out attemps to increase the expression yield of soluble hKAT II. Recombinant expression of hKAT II was investigated by a novel culture method, called EnBase, or enzyme-based-substrate-delivery (BioSilta). EnBase (BioSilta) is an enhanced novel microbial culture system in which enzyme-based supply of glucose allows a glucose-limited growth, providing high cell densities and high recombinant protein yields. The avaibility of higher amounts of hKAT II, together with the tools developed for the high-throughput screening of hKAT II specific inhibitors will be useful in the development of novel drugs for cognitive dysfunction.

L’attività di ricerca svolta durante il corso di dottorato ha riguardato la caratterizzazione biochimica dell’enzima chinurenina aminotransferasi II di origine umana (hKAT II). hKAT II è un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP)-dipendente, coinvolto nella via metabolica di degradazione del triptofano, nota come via della chinurenina, che porta alla formazione di NAD+. Alcuni intermedi di questa via metabolica sono neuroattivi e hanno recentemente assunto particolare interesse per il loro coinvolgimento nell’insorgenza di malattie neurodegenerative. Tra questi metaboliti neuroattivi vi è l’acido chinurenico (KYNA), che deriva dalla transaminazione irreversibile della L-chinurenina (KYN), catalizzata dall’enzima KAT. Fino ad oggi nel cervello dei mammiferi sono state identificate quattro isoforme di questo enzima, denominate KAT I-IV. KAT II è il principale enzima responsabile della sintesi di KYNA a livello cerebrale. KYNA agisce come antagonista di alcuni sottotipi di recettori glutamatergici e colinergici e diversi studi in vivo hanno dimostrato che alterazioni nella sintesi di KYNA sono in grado di influenzare le funzioni cognitive mediate da questi recettori. L’enzima KAT II è quindi un potenziale target farmaceutico per il trattamento di condizioni neuropatologiche caratterizzate da eccesso di KYNA e ipofunzionalità della neurotrasmissione colinergica e glutamatergica, quali schizofrenia e disturbi cognitivi. Nonostante queste importanti implicazioni biologiche e farmacologiche, sino ad oggi non è stata effettuata una estesa caratterizzazione biochimica di questo enzima. Inoltre, solo pochi composti sono attualmente disponibili come inibitori di hKAT II. I principali obiettivi del presente progetto di tesi sono stati i) l’ottimizzazione della resa di espressione mediante un innovativo sistema di crescita cellulare (EnBase BioSilta), ii) la caratterizzazione delle proprietà spettroscopiche di hKAT II in soluzione e allo stato cristallino, iii) la valutazione della propensione di hKAT II a catalizzare reazioni secondarie di b-eliminazione, iv) la messa a punto di nuovi saggi di attività di più facile utilizzo rispetto a quello attualmente riportato in letteratura e applicabili alla determinazione dei parametri catalitici, v) la determinazione dei meccanismi e delle costanti di legame di alcuni composti proposti essere inibitori specifici di hKAT II, e vi) lo sviluppo di un metodo rapido e semplice per lo screening su larga scala (high-throughput screening, HTS) di librerie di composti al fine di individuare nuove molecole in grado di inibire hKAT II. Gli studi condotti durante questo lavoro di tesi hanno permesso di ottenere una dettagliata caratterizzazione biochimica di hKAT II e di sviluppare nuovi saggi di attività applicabili allo sviluppo di farmaci per il trattamento terapeutico di schizofrenia ed altri disturbi cognitivi.