Transcriptional profiling of Bovine Herpesvirus 4 infected bovine endometrial stromal cells

RIASSUNTO Le malattie bovine uterine colpiscono la metà delle bovine da latte dopo il parto, provocando infertilità attraverso la distruzione della funzione ovarica e uterina. Le infezioni del tratto genitale femminile rappresentano un problema economico primario inficiando sulle efficienti prestazioni delle mandrie da latte poiché causano riduzione delle gravidanze e della produzione di latte. Sebbene l'eziologia delle malattie uterine dei bovini sia principalmente attribuita a batteri patogeni, come per esempio Escherichia coli ed Arcanobacterium pyogenes, studi diagnostici più approfonditi, hanno rilevato anche la presenza del Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) in molti dei bovini colpiti, implicando quindi che l'infezione virale possa essere coinvolta in un possibile circolo vizioso. A seguito del riconoscimento del Lipopolisaccaride batterico (LPS) da parte del recettore Toll-like receptor 4 (TLR4) espresso a livello dell'epitelio endometriale bovino, viene attivata l'espressione di fattori immunitari quali la Prostaglandina E (PGE) ed il fattore di Necrosi Tumorale α (TNF-α). Questa cascata di citochine innesca a sua volta, la replicazione di BoHV-4, interagendo con specifici siti all'interno del promotore dell’Immediate Early gene 2 (IE2). Viceversa, l'Interferon gamma (IFN-γ) prodotto dalle cellule del sistema immunitario, inibisce la replicazione virale, agendo sempre a livello del promotore del gene IE2. Per chiarirne il vero ruolo patogenetico e studiare meglio i meccanismi molecolari della risposta fisiopatologica alla base dell'interazione ospite-patogeno, è stata condotta un'infezione sperimentale con BoHV-4 al fine di ottimizzare le condizioni di infezione ed in seguito è stata eseguita un'analisi trascrittomica di una popolazione di cellule stromali endometriali bovine pure (BESC) infettate con BoHV-4. Per l’analisi trascrittomica, è stata applicata la tecnologia dell’RNA-seq che ha permesso di scoprire un insieme di geni differenzialmente espressi (geni DE), tra questi più precisamente, 417 sono risultati essere up-regolati mentre 118 down-regolati durante l'infezione da BoHV-4. I geni DE sono stati successivamente funzionalmente classificati attraverso l'analisi funzionale dell'arricchimento in base al loro coinvolgimento nei vari pathways cellulari. Molti pathways, come per esempio quelli correlati alla proliferazione cellulare ed all'integrità della superficie cellulare, sono risultati essere influenzati dall'infezione con BoHV-4. Inoltre, è stato interessante notare come alcuni geni DE, che si è osservato essere up-regolati, svolgano anche un ruolo chiave nella patogenesi, come nel caso del gene dell’Interleuchina 8 (IL-8) e della metalloproteasi di matrice 1 (MMP-1). L'up-regolazione di MMP-1 non è un dato inaspettato, in quanto MMP-1 appartiene alla famiglia delle endo-peptidasi zinco-dipendenti che sono coinvolte in numerosi e importanti networks cellulari. Grazie ai processi di rimodellamento della Matrice Extracellulare (ECM) ed immuno-modulazione, le metalloproteasi (MMPs) assumono una connotazione rilevante nel particolare contesto della metrite, dove in condizioni favorevoli facilitano l'eradicazione degli agenti patogeni, la risoluzione dello stato infiammatorio ripristinando funzionalmente e anatomicamente i tessuti coinvolti. In alternativa, la disregolazione patogenica e l'iper-attivazione delle MMPs portano ad un incremento della morbidità e mortalità dell’ospite, favorendo così la persistenza e la disseminazione dei patogeni, prevenendo la guarigione dei tessuti e definendo infine uno stato immuno-patologico. In virtù del fatto che questi enzimi svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento del delicato equilibrio tra risposta immunitaria normale ed iper-attivata e per il presunto coinvolgimento di MMP-1 nello sviluppo delle patologie dell'utero bovino, tale gene è stato selezionato come candidato per ulteriori studi come fattore chiave nell’ospite coinvolto nella patogenesi di BoHV-4. Le osservazioni in silico sono state ulteriormente confermate mediante reverse transcription PCR, Real time PCR, Western immunoblotting ed infine un saggio di Luciferasi in cui è stato sfruttato un costrutto reporter caratterizzato dalla presenza dello specifico promotore bovino per MMP-1. Le cellule BESC transfettate con il costrutto reporter e successivamente infettate con BoHV-4 hanno mostrato una crescente espressione della luciferasi all’aumentare della carica virale. È noto che la replicazione di BoHV-4 è promossa dall'espressione del gene IE2, mentre il prodotto proteico di IE2, la proteina RTA/50 è in grado di transattivare sia geni virali che quelli delle cellule ospiti, come quelli per esempio che codificano per la chemochina IL-8. È stato infatti dimostrato come l'espressione dell’IL-8 nelle BESCs infettate aumenta in maniera tempo e dose dipendente, suggerendo quindi una potenziale relazione tra l’up-regolazione di MMP-1, l’espressione del gene IE2 e la replicazione virale. In seguito alla transfezione delle BESCs con un costrutto over esprimente IE2, è stata osservata una correlazione diretta tra l’over espressione della proteina RTA/50 e l’up-regolazione di MMP-1. Questo dato ha giustificato i livelli anormalmente alti di metalloproteinasi nei tessuti suggerendo inoltre una possibile connessione tra il deficit della guarigione endometriale e la permanenza dello stato infiammatorio. Questi dati, in associazione a quelli ottenuti dall'analisi del profilo trascrittomico, rappresentano un significativo passo avanti verso la comprensione del circolo vizioso sopra menzionato; più precisamente sulle relazioni esistenti tra virus, strato endometriale e risposta immunitaria dell'ospite che sostengono la replicazione virale, incrementando così il danno tissutale. La delucidazione quindi dei meccanismi molecolari e dei pathways delle cellule ospiti coinvolti in questa patogenesi è di fondamentale importanza per la scoperta di nuovi target terapeutici basati sulla down-regolazione di MMP-1.

ABSTRACT Bovine postpartum uterine diseases affect half of all dairy cattle after parturition, causing infertility by disrupting uterine and ovarian function. Female genital tract infections are a primary economic problem for efficient performance of dairy herds, as they cause reduced pregnancies as well as reduced milk production. Although the etiology of bovine uterine diseases is mainly ascribed to bacterial pathogens, such as Escherichia coli and Arcanobacterium pyogenes, more extensive diagnostics have in many cases also detected the presence of Bovine Herpesvirus 4 (BoHV-4) in affected cattle, implying that co-infection may be involved in a possible vicious circle. Following recognition of bacterial lipopolysaccharide (LPS) by the Toll-like receptor 4 (TLR4) expressed at the bovine endometrial epithelium level, expression of immune factors such as prostaglandin E (PGE) and Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) are activated. This cytokine cascade triggers BoHV-4 replication by binding specific sites within the immediate early IE2 gene promoter. Conversely, Interferon gamma (IFN-γ) produced by the cells of the immune system, inhibits viral replication, always acting at the level of the IE2 gene promoter. Although BoHV-4 is often isolated from animals affected by these uterine pathologies, and for this reason, consistently associated with postpartum metritis and chronic infertility in cattle, it is difficult to directly correlate the presence of the virus to the pathology in progress, partly because, the cellular pathways and the molecular mechanisms involved are not well defined, as well as which extracellular stimuli related to the intrauterine environment could influence the BoHV-4 replicative cycle. In order to shed light on the true pathogenic role and to better investigate the molecular mechanisms of the physio-pathological response underlying the pathogen-host interaction, an experimental BoHV-4 infection was carried out with the aim to optimize infection conditions and a transcriptomic analysis of a pure bovine endometrial stromal cells population (BESCs) infected with BoHV-4 was performed. The RNA-seq technology used for this purpose allowed to discover a set of differentially expressed genes (DE genes), among which 417 were up-regulated while 118 were down-regulated during BoHV-4 infection. DE genes have been functionally classified through enrichment functional analysis on the basis of their involvement in various cellular pathways. Many pathways, related to cell proliferation and cell surface integrity, were found to be affected by BoHV-4 infection. Some DE genes that were found to be up-regulated also play a key role in pathogenesis as in the case of IL-8 and MMP-1. MMP-1 up-regulation was not unexpected, as it belongs to the zinc-dependent endo-peptidases family involved in numerous and important cellular networks. Thanks to the ECM remodeling and immuno-modulation processes, MMPs assume a relevant connotation in the particular context of metritis, where under suitable conditions favor pathogen eradication, inflammatory state resolution as well as tissue anatomical and functional restoration. Alternatively, pathogenic dysregulation and MMPs hyper-activation leads to host morbidity and mortality thereby favoring pathogen persistence and dissemination, preventing tissue healing and finally defining an immuno-pathological status. By virtue of the fact that these enzymes play a pivotal role in maintaining the delicate balance between normal and hyper-activated immune response and for the putative involvement of MMP-1 in the bovine uterine diseases development, it was selected as a candidate gene for further studies as a key host factor involved in BoHV-4 pathogenesis. The in silico observations were further corroborated by reverse transcription PCR, real time PCR, Western immunoblotting and finally a luciferase assay where a bovine MMP-1 specific promoter reporter construct was exploited. BESC cells transfected with the reporter construct and subsequently infected with BoHV-4 showed an increasing luciferase expression with increasing viral load. BoHV-4 replication is promoted by IE2 gene expression, while the IE2 protein product RTA/50 is able to transactivate both viral and host cell genes, such as those coding for the chemokine IL-8. IL-8 expression in infected BESCs was shown to increase in a time- and dose-dependent manner. This suggested a potential relationship between MMP-1 up-regulation, IE2 gene expression and viral replication. Following BESCs transfection with an IE2 over-expressing construct, a direct correlation between RTA/50 over-expression and MMP-1 up-regulation was observed. This justified the abnormally high metalloproteinase levels in tissues, and suggested a possible connection to the defective endometrium healing and unresolved inflammation state. These data, combined with those obtained by transcriptomic profile analysis, represent significant steps toward understanding the vicious cycle mentioned above, more precisely the existing interactions between virus, endometrial layer and host immune response, which sustain viral replication thereby eliciting tissue damage. Elucidation of the molecular mechanisms and host cell pathways involved in this pathogenesis is central to the discovery of new targets for novel therapeutic treatments based on MMP-1 down-regulation.