Caratterizzazione funzionale di mutanti di lievito recanti mutazioni associate a patologia nei geni codificanti la pantotenato-chinasi e il CoA sintasi e identificazione di soppressori chimici

Mutations in panthotenate kinase (PANK2) and coenzyme A synthase (CoASY), both implicated in CoA biosynthesis, lead, respectively, to PKAN and CoPAN diseases, forms of neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA). CoA is a fundamental cofactor in several metabolic pathways as well as tricarboxylic acid cycle, fatty acid metabolism, amino acid biosynthesis, and histone and non-histone protein acetylation. Although iron accumulation is a hallmark of PKAN and CoPAN, its relationship with CoA dysfunction is not yet clear and many questions concerning their pathogenesis remain unanswered, in particular whether or not iron accumulation is the primary cause of the diseases. The different PKAN models, so far obtained, have generated incomplete phenotypes and do not show iron accumulation. An interesting and unexplored model for these disorders is yeast; we therefore decided to construct and characterize a yeast model of PKAN and CoPAN, namely yeast strains expressing pathological variants in the corresponding yeast proteins. These mutant strains showed mitochondrial dysfunction, altered lipid metabolism, iron overload and oxidative damage; establishing yeast as a useful model to clarify the pathogenesis underlying these diseases. Finally taking advantage of the phenotype of the PKAN yeast model we performed a screening of Selleck-FDA approved chemical library in order to identify chemical suppressors i.e. potential therapeutic drugs for PKAN treatment. Two molecules in particular were identified, 5,7 dichloro-8 hydroxyquinoline (CQCL) and nalidixic acid (nalH), able to restore the respiratory growth of mutant strain. Moreover the addition of CQCL or nalH in the growth medium, rescued all the phenotypes associated to CoA deficiency. Since both molecules are able to bind several metals, we hypothesize that the mechanism underlying their rescue ability lies on their property to chelate the excess of iron thus reducing oxidative stress. Although very recently has been demonstrated the therapeutic effect of exogenous CoA administration in reverting pathological phenotypes in PKAN‐derived neurons, in the future the compounds identified could be tested in vitro on available hiPS-derived neuronal cells and in vivo on zebrafish model and/or on knok out mouse model.

Mutazioni nella pantotenato chinasi (PANK2) e nel coenzima A sintasi (CoASY), entrambi implicati nella biosintesi del CoA, portano, rispettivamente, alle patologie PKAN e CoPAN, forme di neurodegenerazioni con accumulo di ferro a livello cerebrale (NBIA). Il CoA è un cofattore fondamentale in numerosi pathways metabolici quali il ciclo di Krebs, il metabolismo degli acidi grassi, la biosintesi degli aminoacidi e l’acetilazione delle proteine istoniche e non. Sebbene l’accumulo di ferro sia una caratteristica sia della PKAN che di CoPAN, quale sia la relazione con il deficit di CoA non è ancora chiara e molte domande riguardanti le basi molecolari che sottendono a queste patologie non hanno ancora risposta, in particolare se sia o no l’accumulo di ferro la causa primaria delle patologie. I diversi modelli PKAN, ottenuti fino ad oggi, ricapitolano solo parzialmente il fenotipo riscontrato nei pazienti e non mostrano accumulo di ferro. Un interessante e inesplorato modello per queste malattie è il lievito; pertanto abbiamo deciso di costruire e caratterizzare il modello lievito sia di PKAN che di CoPAN, ovvero ceppi di lievito esprimenti varianti patologiche nelle corrispondenti proteine di lievito. Questi ceppi mutanti hanno mostrato una alterazione della funzionalità mitocondriale, un alterato metabolismo dei lipidi, accumulo di ferro e danno ossidativo. Questi risultati indicano che il lievito sia un buon modello per chiarire la patogenesi alla base di tali malattie. Infine, sfruttando il fenotipo del modello lievito PKAN, abbiamo effettuato lo screening di una libreria di molecole ( Selleck-FDA approved library) per identificare soppressori chimici ovvero potenziali molecole terapeutiche per il trattamento della PKAN. In particolare abbiamo identificato due molecole, la 5,7 dicloro-8-idrossichinolina (CQCL) e l’acido nalidixco (nalH) in grado di rispristinare il difetto di crescita ossidativa presentato dal mutante. Inoltre l’aggiunta di CQCL o nalH al terreno di crescita, portava alla soppressione di tutti i fenotipi associati al deficit di CoA. Dal momento che entrambe le molecole sono in grado di legare diversi metalli abbiamo ipotizzato che il meccanismo alla base della loro capacità di fare rescue risieda nella loro proprietà di chelare il ferro in eccesso riducendo cosi lo stress ossidativo. Sebbene molto recentemente sia stato dimostrato che la somministrazione di CoA ripristina i fenotipi patologici dei neuroni PKAN derivati, in futuro i composti identificati potranno essere testati in vitro sulle hiPS-derived neuronal cells e in vivo sia sul modello zebrafish che sul modello topo knok out .