Possibile ruolo regolatorio della proteina citocheratina 8 del sistema dei filamenti intermedi del citoscheletro sull’infezione sperimentale del virus influenza A/NWS/33 (H1N1) in modelli cellulari di mammifero

The aim of this study was to investigate the involvement of cytoskeletal intermediate filaments in the human influenza A/NWS/33 virus (H1N1) infection using two mammalian cell models, in order to find out new cellular restriction factors. Specifically, the role of cytokeratin 8 and its post-translational modification, the phosphorylated state, were examined during NWS/33 virus infection in semi-permissive rhesus monkey-kidney (LLC-MK2) and permissive human lung (A549) epithelial cells. In order to analyse the effects induced by intermediate filaments depolymerisation, cell monolayers were treated with acrylamide. Major morphological changes were observed in LLC-MK2 cells, where cytokeratin 8 was poorly expressed and organized in filaments, when compared to A549 cells. Although acrylamide increased the expression of NWS/33 virus nucleoprotein (NP) in both models, the corresponding viral yield slightly diminished. These data suggest that NWS/33 virus might take advantage of a highly dynamic state of intermediate filaments during the early stages of infection, but not during the latest stages. The effects induced by NWS/33 virus infection evidenced that the cytokeratin 8 organization is subverted during the latest stages of the infection in both models. Furthermore, NWS/33 virus was able to promote cytokeratin 8 phosphorylation only in A549 cells at early phases of infection. These results demonstrate that there is a very exclusive “relationship” occurring between influenza virus and the host cell. In particular, NWS/33 virus is able to take advantages of the modification of the cytokeratin 8 organization during the early stages of infection in the A549 model. In addition, the confocal microscopy analysis of the early stages of infection showed the co-localization of viral NP with cytokeratin 8, and its phosphorylated component in A549 cells, but not in LLC-MK2 cells, where only a weak co-localization of NP with cytokeratin 8 was observed. The treatment with two chemical activators of the phosphorylation (i.e. okadaic acid and 12-O-tetradecanoylforbol-13-acetate) induced major structural changes of cytokeratin 8 in A549 cells. Additionally, these treatments increased cytokeratin 8 phosphorylation, favoring the NWS/33 virus replicative efficiency only in A549 cells. Subsequently, a molecular approach was applied. The silencing of the gene "Ras homolog enriched in brain like-1" (RhebL1) involved in the phosphorylation pathway showed an increased phosphorylation of cytokeratin 8 in both models, and positive effects on the outcome of NWS/33 virus infection only in A549 cells. Consistent with these findings, in epithelial respiratory cells from paediatric patients with acute respiratory disease it was assessed that cytokeratin 8 phosphorylation was increased by influenza A virus, but not by respiratory syncytial virus infection. Therefore, influenza A virus is able to hijack the phosphorylation mechanism also "in vivo", which seems to be virus-dependent. The obtained results implemented the available information about the role of intermediate filaments during viral infection. In particular, we showed that in permissive cells (i.e. A549 and respiratory epithelial cells) influenza virus is able to co-opt cytokeratin 8 to enhance its own replication. On the contrary, in semi-permissive LLC-MK2 cells, where other cytoskeletal restriction factors were previously assessed, the NWS/33 strain does not take advantage of cytokeratin 8 phosphorylation for its replication. In conclusion, these data highlight the complex interplay occurring between influenza virus and intermediate filaments, whose regulatory mechanisms require further in-depth studies.

L’obiettivo principale di questa tesi è stato quello di sondare l’implicazione del sistema dei filamenti intermedi del citoscheletro cellulare nello svolgimento del ciclo replicativo del virus influenza umano A/NWS/33 (H1N1) in due modelli cellulari di mammifero a differente grado di permissività, al fine di individuare possibili fattori cellulari di restrizione all’infezione. Nello specifico, è stato esaminato il ruolo della componente citocheratina 8 dei filamenti intermedi e di una sua modificazione post-traduzionale, consistente nella fosforilazione, in corso di infezione sperimentale con il virus NWS/33; questa è stata condotta, a confronto, nelle cellule LLC-MK2 (rene di scimmia, modello semi-permissivo) e nelle cellule A549 (polmone umano, modello permissivo). I risultati ottenuti in seguito alla depolimerizzazione dei filamenti intermedi con la sostanza acrilammide hanno evidenziato la comparsa di modificazioni strutturali più evidenti nelle cellule LLC-MK2, dove peraltro citocheratina 8 ha un livello di espressione e di organizzazione in filamenti più esiguo, rispetto alle cellule A549. Sebbene la depolimerizzazione dei filamenti intermedi abbia esercitato effetti positivi sull’espressione della nucleoproteina (NP) del virus NWS/33 in entrambi i modelli, non sono stati ottenuti esiti analoghi per quanto riguarda i titoli infettanti della progenie virale, che sono risultati di entità lievemente inferiore. Tali osservazioni depongono per il fatto che un assetto altamente dinamico dei filamenti intermedi, quale quello indotto da acrilammide, si rivela congeniale allo svolgimento delle attività biosintetiche virali, ma, verosimilmente, ostacola l’emergenza della progenie virale, interferendo con le fasi tardive dell’infezione. L’analisi degli effetti indotti dal virus NWS/33 nei due modelli cellulari allo studio ha rivelato che citocheratina 8 viene modificata solo in fasi tardive dell’infezione. Inoltre, il virus NWS/33 è in grado di aumentare la fosforilazione di citocheratina 8 solo nelle cellule A549, a partire da fasi precoci dell’infezione. Tali dati evidenziano l’univocità dell’interazione virus-cellula ospite, in quanto solo nel modello permissivo il virus NWS/33 è in grado di modificare precocemente l’assetto di citocheratina 8, sfruttando l’attivazione della fosforilazione, che contribuisce ad aumentare la dinamicità di tale componente del citoscheletro. Tali risultati sono stati successivamente suffragati dalle osservazioni desunte dall’analisi in microscopia confocale, che ha evidenziato la co-localizzazione della NP virale con citocheratina 8 e la sua componente fosforilata nel corso di fasi precoci dell’infezione nelle cellule A549, ma non nelle cellule LLC-MK2, dove è stata evidenziata solo una debole co-localizzazione con citocheratina 8. Il trattamento dei modelli cellulari allo studio con sostanze chimiche (i.e. acido okadaico e 12-O-tetradecanoilforbolo-13-acetato) in grado di attivare la fosforilazione ha indotto delle modificazioni strutturali di citocheratina 8 più evidenti nelle cellule A549. Peraltro, l’aumento della fosforilazione di citocheratina 8 indotto da tali sostanze ha favorito l’espletamento del ciclo replicativo virale nelle cellule A549, al contrario di quanto osservato nelle LLC-MK2. Allo scopo di sondare ulteriormente le implicazioni della fosforilazione di citocheratina 8 sul ciclo replicativo virale, è stato impiegato un approccio molecolare che prevedeva il silenziamento del gene codificante per la proteina regolatoria “Ras homolog enriched in brain like-1” (RhebL1). I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento della fosforilazione di citocheratina 8 in entrambi i modelli, oltre a ripercussioni positive sull’esito dell’infezione virale nelle cellule A549. Al fine di estendere le osservazioni ottenute anche alle cellule dell’epitelio respiratorio umano, che rappresentano il primo bersaglio dell’infezione del virus influenza, sono stati esaminati dei campioni dell’apparato respiratorio di pazienti pediatrici. L’analisi ha permesso di evidenziare che nelle cellule positive per il virus influenza A, ma non per il virus respiratorio sinciziale, si assiste a un aumento della fosforilazione di citocheratina 8. Tali risultati attestano che il virus influenza A impiega anche “in vivo” un meccanismo di attivazione della fosforilazione verosimilmente analogo a quello individuato nel modello permissivo A549 e strettamente virus-dipendente. I risultati ottenuti consentono, innanzitutto, di implementare le scarse informazioni finora disponibili in letteratura relativamente al ruolo dei filamenti intermedi in corso di infezione virale. Nello specifico, è stato appurato che in modelli cellulari permissivi (i.e. A549 e cellule dell’epitelio respiratorio) il virus è in grado di cooptare, a proprio vantaggio, citocheratina 8 e di modularne la fosforilazione, al fine di potenziare ulteriormente il suo ciclo replicativo. Al contrario, nel modello semi-permissivo LLC-MK2, dove precedenti osservazioni sperimentali ottenute dal gruppo di ricerca avevano consentito di evidenziare altri fattori di restrizione correlati al citoscheletro, la fosforilazione di citocheratina 8 non sembra essere funzionale al virus per aumentare la sua efficienza replicativa. Nell’insieme, i dati ottenuti evidenziano la complessità dell’interazione che si esprime tra virus e filamenti intermedi del citoscheletro cellulare, i cui meccanismi di regolazione dovranno essere oggetto di ulteriori studi e approfondimenti.