Lo sviluppo di vaccini contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) ha fatto uso di numerosi modelli animali per testare diversi approcci vaccinali e per caratterizzare i correlati di protezione. Tra questi, il virus dell’immunodeficienza felina (FIV) rappresenta un valido strumento, dal momento che la sindrome che esso provoca nel gatto è estremamente simile all’AIDS umana ma il virus non trasmissibile all’uomo. Inoltre, i costi necessari alla stabulazione e al mantenimento degli animali sono notevolmente inferiori rispetto a quelli dei primati non umani. Per questo motivo FIV è stato utilizzato in numerosi approcci vaccinali da utilizzare come modello per lo studio di HIV. I vaccini inattivati contro agenti infettivi di solito sono costituiti dall’intero patogeno fissato o da una o più proteine strutturali. Queste strategie sono state esplorate anche contro HIV, ma, nonostante l’uso di numerosi adiuvanti e diversi metodi di somministrazione, attualmente non è ancora disponibile un vaccino efficace. Per questo motivo sono stati esplorati nuovi approcci, come l’uso di proteine regolatorie o accessorie come antigeni vaccinali. Infatti, oltre alle tre open reading frame (ORF) maggiori, gag, pol ed env, entrambi i virus codificano anche per proteine non direttamente coinvolte nel replicazione virale e per questo sono dette accessorie. HIV ne ha sei, mentre FIV solo tre: Vif, il fattore di infettività virale, Rev, coinvolta nel processamento post-trascrizionale dei messaggeri, e ORF-A. Quest’ultima è nota per essere essenziale per l’infezione di cellule linfoidi primarie, per la sua capacità transattivante e per la modulazione del ciclo cellulare. A causa delle sue caratteristiche, quindi, lo studio di questa proteina può rivelarsi estremamente utile per capire i meccanismi attraverso cui il virus infetta le cellule e si diffonde all’interno dell’ospite e può fornire importanti indicazioni sulla validità delle proteine accessorie come antigeni vaccinali. Per studiare le funzioni di ORF-A, sono state prodotte versioni mutate, ottimizzate e di fusione della proteina. Tramite la proteina di fusione con GST è stato valutato il ruolo di ORF-A nella transattivazione delle LTR di FIV: il risultato ha evidenziato un più elevato livello di attività basale dei promotori di FIV se paragonato a quelli di HIV ma un’attività transattivante di ORF-A più debole rispetto a quella di Tat. E’ stata inoltre analizzata la capacità di ORF-A di essere internalizzata dalle cellule circostanti, come avviene per Tat. Utilizzando una proteina di fusione GST/ORF-A/GFP è stato osservato che anche ORF-A è internalizzata e che questa caratteristica è dovuta al suo dominio basico. A causa dei bassi livelli di espressione di questa proteina e della difficoltà di utilizzare linfociti e macrofagi, target naturali di infezione da FIV, la maggior parte degli studi precedenti sono stati effettuati in fibroblasti felini, più facili da manipolare ma nei quali ORF-A non è necessaria per una corretta replicazione del virus ed ha probabilmente localizzazione diversa. Per superare questo problema e valutare l’attività della proteina in cellule linfoidi ne è stata prodotta una versione ottimizzata, la cui espressione è decisamente maggiore rispetto alla forma wild-type. Inoltre, per valutare il suo ruolo durante la replicazione virale, sono stati testati diversi cloni di FIV in cui la proteina risultava mutata o assente. Questi mutanti sono stati utilizzati per infettare cellule feline quali fibroblasti, linfociti, primari e non, e macrofagi. La forma ottimizzata è stata anche utilizzata in studi con il microscopio confocale per valutare la localizzazione intracellulare della proteina, che è risultata essere di tipo nucleare. In conclusione, gli studi effettuati contribuiscono a definire le caratteristiche principali di ORF-A, l’unica delle proteine di FIV la cui funzione non è ancora stata chiarita in dettaglio. I risultati ottenuti delineano una proteina multifunzionale (caratteristica condivisa da molte proteine di virus con genomi di piccole dimensioni come FIV), che si è rivelata essenziale per la replicazione nelle cellule target dell’infezione e che potrebbe rappresentare un buon target per eventuali strategie terapeutiche e profilattiche.

Ruolo della proteina accessoria ORF-A nell’infezione da virus dell’immunodeficienza felina

CONTI, FRANCESCA
2010

Abstract

Lo sviluppo di vaccini contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) ha fatto uso di numerosi modelli animali per testare diversi approcci vaccinali e per caratterizzare i correlati di protezione. Tra questi, il virus dell’immunodeficienza felina (FIV) rappresenta un valido strumento, dal momento che la sindrome che esso provoca nel gatto è estremamente simile all’AIDS umana ma il virus non trasmissibile all’uomo. Inoltre, i costi necessari alla stabulazione e al mantenimento degli animali sono notevolmente inferiori rispetto a quelli dei primati non umani. Per questo motivo FIV è stato utilizzato in numerosi approcci vaccinali da utilizzare come modello per lo studio di HIV. I vaccini inattivati contro agenti infettivi di solito sono costituiti dall’intero patogeno fissato o da una o più proteine strutturali. Queste strategie sono state esplorate anche contro HIV, ma, nonostante l’uso di numerosi adiuvanti e diversi metodi di somministrazione, attualmente non è ancora disponibile un vaccino efficace. Per questo motivo sono stati esplorati nuovi approcci, come l’uso di proteine regolatorie o accessorie come antigeni vaccinali. Infatti, oltre alle tre open reading frame (ORF) maggiori, gag, pol ed env, entrambi i virus codificano anche per proteine non direttamente coinvolte nel replicazione virale e per questo sono dette accessorie. HIV ne ha sei, mentre FIV solo tre: Vif, il fattore di infettività virale, Rev, coinvolta nel processamento post-trascrizionale dei messaggeri, e ORF-A. Quest’ultima è nota per essere essenziale per l’infezione di cellule linfoidi primarie, per la sua capacità transattivante e per la modulazione del ciclo cellulare. A causa delle sue caratteristiche, quindi, lo studio di questa proteina può rivelarsi estremamente utile per capire i meccanismi attraverso cui il virus infetta le cellule e si diffonde all’interno dell’ospite e può fornire importanti indicazioni sulla validità delle proteine accessorie come antigeni vaccinali. Per studiare le funzioni di ORF-A, sono state prodotte versioni mutate, ottimizzate e di fusione della proteina. Tramite la proteina di fusione con GST è stato valutato il ruolo di ORF-A nella transattivazione delle LTR di FIV: il risultato ha evidenziato un più elevato livello di attività basale dei promotori di FIV se paragonato a quelli di HIV ma un’attività transattivante di ORF-A più debole rispetto a quella di Tat. E’ stata inoltre analizzata la capacità di ORF-A di essere internalizzata dalle cellule circostanti, come avviene per Tat. Utilizzando una proteina di fusione GST/ORF-A/GFP è stato osservato che anche ORF-A è internalizzata e che questa caratteristica è dovuta al suo dominio basico. A causa dei bassi livelli di espressione di questa proteina e della difficoltà di utilizzare linfociti e macrofagi, target naturali di infezione da FIV, la maggior parte degli studi precedenti sono stati effettuati in fibroblasti felini, più facili da manipolare ma nei quali ORF-A non è necessaria per una corretta replicazione del virus ed ha probabilmente localizzazione diversa. Per superare questo problema e valutare l’attività della proteina in cellule linfoidi ne è stata prodotta una versione ottimizzata, la cui espressione è decisamente maggiore rispetto alla forma wild-type. Inoltre, per valutare il suo ruolo durante la replicazione virale, sono stati testati diversi cloni di FIV in cui la proteina risultava mutata o assente. Questi mutanti sono stati utilizzati per infettare cellule feline quali fibroblasti, linfociti, primari e non, e macrofagi. La forma ottimizzata è stata anche utilizzata in studi con il microscopio confocale per valutare la localizzazione intracellulare della proteina, che è risultata essere di tipo nucleare. In conclusione, gli studi effettuati contribuiscono a definire le caratteristiche principali di ORF-A, l’unica delle proteine di FIV la cui funzione non è ancora stata chiarita in dettaglio. I risultati ottenuti delineano una proteina multifunzionale (caratteristica condivisa da molte proteine di virus con genomi di piccole dimensioni come FIV), che si è rivelata essenziale per la replicazione nelle cellule target dell’infezione e che potrebbe rappresentare un buon target per eventuali strategie terapeutiche e profilattiche.
14-apr-2010
Italiano
FIV
ORF-A
Pistello, Mauro
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Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIPI-154831