Rivelare il potenziale delle vescicole extracellulari astrocitarie: una nuova frontiera per potenziare la riparazione cerebrale nella malattia di Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer's disease, defined by motor and non-motor symptoms. The degenerative process is characterized by the loss of dopaminergic (DAergic) neurons in the ventral midbrain (VMB) and their projections in the striatum (STR), resulting in a reduction of dopamine levels. To date the causes of PD are still poorly understood, and there are no therapies able to stop or reverse the pathology. In this context, a pivotal role is played by the glial compartment, through a bi-directional signaling with neurons. Indeed, astrocytes and microglia are able to respond to brain damage by releasing neurotrophic and pro-inflammatory factors. Depending on the context, these factors can either promote neuroprotection or contribute to neurodegeneration. However, the molecular mechanisms regulating this complex intercellular signaling are not yet clear. In the last 15-20 years, extracellular vesicles (EVs) have emerged as important mediators of intercellular communication, both in physiological and pathological conditions. EVs are membranous nanostructures released by all cell types, and they are able to transfer different classes of molecules to target cells. They are also considered a promising source of new biomarkers and potential innovative nanotherapeutics, delivering pharmacologically active molecules in a targeted manner. In the context of PD, glia-derived EVs have controversial role, reflecting the behavior of donor cells. In particular, astrocytes “activated” by CCL3 chemokine, protect damaged DAergic neurons both in in vivo and in vitro PD models. This is possible thanks to the astrocyte-neuron cross-talk, where EVs may play a key role. The main objective of this doctoral project was to study nigrostriatal EVs and their role in PD. Specifically, EVs derived from astrocytes of the nigrostriatal system (VMB and STR) were characterized, and their role in astrocyte-neuron intercellular communication was analyzed. In order to do this, we also developed a PD cellular model, dissected by high-resolution respirometry. Results indicated that VMB astrocytes release more vesicles than STR and other brain regions, and are able to respond to CCL3 treatment by increasing EV production. Moreover, we also studied the neuroprotective potential of nigrostriatal astrocyte-derived EVs in in vitro PD models. Analyses showed that EVs from CCL3 pre-treated astrocytes had a greater neuroprotective effect against H2O2-induced apoptosis, confirming the therapeutic potential of this cytokine. Furthermore, after exposure to MPP+, all EVs recovered electron transport chain complex I functionality, but only VMB astrocyte- derived EVs fully restored ATP levels. These findings show astrocyte regional diversities in the nigrostriatal system, both in term of EV secretion and function, with significant implications for PD. To develop new therapeutic approaches, understanding the molecular dynamics of EV interaction and uptake by target neurons is crucial. In order to do this, a mathematical model was developed based on laboratory data, useful for optimizing translational studies using EVs. In the long term, knowledge stemming from this research may have significant implications, not only enhancing the understanding of molecular mechanisms underlying the complex glia-neuron crosstalk but also implementing the design of innovative therapies using EVs for PD treatment.

La malattia di Parkinson (MP), dopo l’Alzheimer, è il disturbo neurodegenerativo più diffuso, con la comparsa di disturbi sia motori che non-motori. Il processo degenerativo è caratterizzato dalla perdita dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale (VMB) e delle loro proiezioni nello striato (STR), con conseguente riduzione della dopamina. Ad oggi, le cause della MP sono ancora poco note, e non esistono terapie curative. In questo contesto, un ruolo essenziale viene svolto dalla glia, mediante una segnalazione bidirezionale con i neuroni. Astrociti e microglia sono in grado di rispondere al danno cerebrale con il rilascio di fattori neurotrofici e pro-infiammatori, che possono favorire la neuroprotezione, oppure contribuire alla neurodegenerazione. I meccanismi molecolari che regolano questo complesso signaling intercellulare non sono, tuttavia, ancora chiari. Negli ultimi 15-20 anni le vescicole extracellulari (EVs) sono emerse come importanti mediatori della comunicazione intercellulare, implicati in processi fisiologici e patologici. Le EVs sono nanostrutture membranose rilasciate da tutti i tipi di cellule, ed in grado di trasferire alle cellule bersaglio diverse classi di molecole. Le EVs sono anche una promettente fonte di nuovi biomarcatori e potenziali nanoterapeutici innovativi, poiché in grado di veicolare molecole ad azione farmacologica in maniera mirata. Nel contesto della MP, le EVs prodotte dalla glia presentano ruoli controversi, riflettendo di fatto il comportamento delle cellule donatrici. In particolare, gli astrociti “attivati” dalla chemochina CCL3, proteggono i neuroni dopaminergici danneggiati, come dimostrato sia in modelli in vitro che in vivo di MP. Ciò avviene attraverso l’attivazione di un cross-talk astrocita-neurone, in cui le EVs potrebbero svolgere un ruolo chiave. Obiettivo principale di questo progetto di dottorato è stato proprio quello di studiare le EVs nigrostriatali ed il loro ruolo nella MP. In particolare, abbiamo caratterizzato le EVs derivanti dagli astrociti del sistema nigrostriatale (VMB e STR), ed analizzato il loro ruolo nella comunicazione intercellulare astrocita-neurone. Per fare questo, abbiamo anche perfezionato un modello cellulare di MP, che è stato poi dissezionato mediante respirometria ad alta risoluzione. Dai risultati è emerso che gli astrociti del VMB producono più vescicole rispetto allo STR e ad altre regioni cerebrali, e rispondono al trattamento con CCL3 incrementando la produzione di EVs. Abbiamo inoltre studiato il potenziale neuroprotettivo delle EVs derivanti dagli astrociti nigrostriatali su modelli in vitro di MP. Le analisi hanno mostrato che, sebbene tutte le EVs siano in grado di contrastare l’apoptosi indotta da H2O2, quelle derivanti dagli astrociti pretrattati con CCL3 hanno un effetto neuroprotettivo maggiore, confermando il potenziale terapeutico di tale citochina. Inoltre, a seguito dell’esposizione a MPP+, tutte le EVs sono in grado di ripristinare la funzionalità del complesso I della catena di trasporto degli elettroni, ma solo le EVs derivanti dagli astrociti del VMB ristabiliscono pienamente i livelli di ATP. Questi risultati enfatizzano le diversità regionali astrocitarie nel sistema nigrostriatale, anche per la secrezione e la funzione delle EVs, con importanti implicazioni applicative per il PD. Per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici è necessario poi comprendere le dinamiche molecolari di interazione ed assorbimento delle EVs da parte dei neuroni bersaglio. Per quantificare in maniera diretta il livello di uptake delle vescicole nel tempo, a partire dai dati di laboratorio, abbiamo infine sviluppato un modello matematico che possa essere utile per ottimizzare la progettazione di studi traslazionali basati sull’uso delle EVs. Nel lungo termine, le conoscenze derivanti da questa linea di ricerca potranno avere ricadute importanti, non solo accrescendo la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del complesso crosstalk glia-neuroni, ma anche implementando la progettazione di terapie innovative basate sull’utilizzo delle EVs per il trattamento della MP.