Rational drug design of new efflux pump inhibitors of Gram-negative bacteria: novel in silico/in vitro combined approach to overcome antimicrobial resistance.

The project aims to address antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria through efflux pump inhibitors (EPIs). Starting with berberine, a natural alkaloid, its ability to reduce the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of tobramycin in highly resistant strains of Pseudomonas aeruginosa was demonstrated. Berberine was found to strongly bind to the MexY protein within the MexXY-OprM efflux system, through computational techniques and in vitro microbiological assays. Derivatives of berberine were synthesized and functionalized at the C-13 position to enhance EPI activity and binding specificity. Computational analysis explored the binding modes of the synthesized derivatives. Inhibitory activity was tested through in vitro assays, using tobramycin. Results showed that chemical substitutions at C13 improve the compounds' specificity for the inhibition site more than berberine itself, aiding in reducing tobramycin MIC in laboratory and clinical strains with EP overexpression. The polymorphism of the MexY protein was considered to evaluate how ligands may be affected in their positioning, affinity, and stability within the binding pocket.

Lo studio riguarda lo sviluppo innovativo di composti che agiscano come inibitori di particolari sistemi di efflusso batterici, nell'ambito della resistenza antimicrobica. il focus è sui batteri Gram-negativi in particolar modo sullo P.aeruginosa, ed uno suo specifico meccanismo primario di resistenza: il sistema MeXY-OprM. Si parte da un composto lead: la Berberina, un alcaloide naturale noto per ridurre in vitro la concentrazione inibitoria minima (MIC) di Tobramicina in ceppi altamente resistenti di Pseudomonas aeruginosa. Viene dimostrata un'alta affinità di legame di Berberina con la proteina MexY all'interno del sistema EP MexXY-OprM e il meccanismo d'azione viene chiarito mediante tecniche computazionali e prove microbiologiche in vitro. Per potenziare l'attività degli inibitori e la loro specificità di legame, vengono sintetizzati derivati di Berberina funzionalizzati nella posizione C-13. Le modalità di legame di questi derivati vengono esplorate mediante metodi computazionali. La loro attività inibitoria, valutata tramite saggi checkerboard in vitro in combinazione con Tobramicina. Si dimostra che le sostituzioni chimiche apolari sull'anello aromatico migliorano la specificità degli inibitori rispetto a Berberina stessa. Questo miglioramento aumenta l'efficacia nel ridurre la MIC di Tobramicina in ceppi di laboratorio e clinici che sovra esprimono il sistema di efflusso in questione. Viene anche suggerita la considerazione del polimorfismo della proteina MexY per valutare come i ligandi possano essere influenzati nel loro posizionamento, affinità e stabilità all'interno della tasca di legame.