Proteomica degli exosomi urinari per la ricerca di biomarcatori nella nefropatia diabetica e nelle tubulopatie ereditarie

Le urine costituiscono il fluido biologico di elezione nella ricerca di biomarcatori per le patologie renali in quanto possono essere raccolte in modo semplice e non invasivo; una strategia per la semplificazione del proteoma urinario è rappresentata dall’isolamento degli exosomi urinari (UE), nanovescicole di membrana (30-100 nm) rilasciate dalle cellule epiteliali nello spazio urinario. In questo lavoro abbiamo focalizzato l’attenzione sulla nefropatia diabetica (DN), una comune complicazione del diabete ed una delle cause più frequenti di insufficienza renale terminale (ESDR), e sulle tubulopatie ereditarie (SLTs), un gruppo eterogeneo di malattie genetiche rare dell’età pediatrica caratterizzate da difetti in proteine coinvolte nel riassorbimento di sodio-cloruro a livello dell’ansa di Henle e/o dei tubuli renali distali, come i cotrasportatori NCC NKCC2, alterati rispettivamente nella sindrome di Gitelman (GS) e nella sindrome di Bartter1 (B1). L’obiettivo che ci siamo proposti è stato quello di studiare il proteoma degli UE in: 1) un modello animale di DN, i ratti ZDF (Zucker Diabetic Fatty), e corrispondenti controlli, per l’identificazione di potenziali biomarcatori diagnostici/prognostici e 2) pazienti affetti da SLTs e controlli sani al fine di proporre un approccio diagnostico complementare/alternativo all’analisi genetica e fornire un punto di partenza per la ricerca di biomarcatori. Per quanto riguarda lo studio della DN, sono state raccolte le urine delle 24 ore da 7 ratti ZDF e controlli a differenti età per monitorare l’evoluzione della DN, gli UE sono stati isolati mediante ultracentrifugazione, seguita da caratterizzazione biochimica. Dopo l’allestimento di un pool rappresentativo di UE di ratti ZDF e controlli a 20 settimane, ne è stato analizzato il proteoma tramite LC-ESI-MS/MS portando all’identificazione ed alla quantificazione label-free di 286 proteine. Il contenuto differenziale di alcune di queste proteine è stato confermato tramite immunoblotting; il contenuto della Major-Urinary-Protein-1 è risultato significativamente più alto, quello della proteina Xaa-Pro-Dipeptidase più basso e quello della Neprilisina invariato, rispettivamente, negli UE di ratti ZDF rispetto ai controlli. Per quanto riguarda le SLTs, la casistica era formata da 32 pazienti SLTs già studiati dal punto di vista genetico e biochimico-clinico, da 4 pazienti SLTs non classificabili e da 22 controlli sani. Dopo la raccolta delle seconde urine del mattino, sono stati isolati e caratterizzati gli UE. I risultati hanno mostrato che il segnale relativo al cotrasportatore NCC risulta significativamente ridotto o assente negli UE dei pazienti GS rispetto ai controlli, e allo stesso modo il cotrasportatore NKCC2 per i pazienti B1. Le differenze nei livelli di queste due proteine negli UE ci consentono il riconoscimento dei pazienti GS e B1 rispetto ai controlli e, in combinazione con i dati biochimico-clinici, rispetto agli altri pazienti Bartter. E’ stato quindi proposto e validato statisticamente un approccio diagnostico che può risultare utile in casi di SLTs a diagnosi incerta. Per quanto riguarda la proteina NCC è stata inoltre effettuata una correlazione tra la quantità del trasportatore presente negli UE e la gravità della mutazione corrispondente. Per l’identificazione di biomarcatori delle altre due forme di SLTs studiate, la sindrome di Bartter2 (B2) e di Bartter3 (B3), abbiamo allestito un pool di UE, abbiamo separato le proteine mediante elettroforesi bidimensionale selezionando alcuni spot differenziali da analizzare tramite LC-ESI-MS/MS; il contenuto differenziale negli UE di alcune proteine identificate verrà validato mediante IB. In conclusione possiamo affermare che la composizione proteica degli UE risulta alterata in maniera riproducibile in presenza di nefropatia diabetica e di tubulopatie ereditarie; le differenze evidenziate possono costituire un punto di partenza per l’identificazione di biomarcatori diagnostici/prognostici e per il chiarimento dei meccanismi patogenetici di tali malattie.