Svelare l'Impatto Trascrizionale del Priming con SNP sulla Resilienza alla Siccità negli Agrumi

Water stress is one of the most critical environmental factors causing unpredictable agricultural losses worldwide, especially in semi-arid regions like southern Italy and Spain, where citrus trees are cultivated. Water stress triggers the accumulation of reactive oxygen species (ROS), leading to secondary oxidative stress in plant cells. Priming is a process in which plants, after being exposed to mild stress or chemical treatments, enhance their ability to respond more effectively to future stresses, improving both resilience and tolerance. Rootstocks resilient to abiotic stress are a widely used strategy to improve drought tolerance in many plant species, including Citrus spp. This project aims to evaluate the effects of sodium nitroprusside-priming (SNP-priming) on citrus plants subjected to drought stress. Initial research focused on physiological changes and transcriptomic rearrangements in two citrus rootstocks (Carrizo citrange and Bitters C22) exposed to PEG-induced drought. Stress levels were assessed by measuring leaf malonyl dialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) content, followed by RNA sequencing and de novo assembly. Weighted Gene Correlation Network Analysis (WGCNA) was used to link gene expression to MDA and H₂O₂ levels. Plant visual inspection and MDA and H₂O₂ contents clearly indicate that Bitters is more tolerant than Carrizo towards PEG-induced drought stress. RNA-Seq analysis and WGCNA identified transcription factors significantly correlated with MDA and H₂O₂ levels in Carrizo, selected as candidate genes for drought tolerance. Successively, the effects of SNP-priming on citrus plants subjected to drought stress were assessed. The effects of priming were evaluated on Bitters C22 subjected to water scarcity, as being more promising than Carrizo in terms of drought tolerance. Primed Bitters C22 plants showed significantly higher drought tolerance than non-primed ones. The RNA-seq analysis revealed that priming, followed by drought stress, regulated a broad spectrum of stress responses, enhancing photosynthetic efficiency, reallocating energy, and reinforcing external barriers and xylem vessels. Additionally, auxin regulation was activated, while ethylene pathways were repressed. Finally, three candidate genes were functionally characterised by ectopic expression in tomato plants. The candidate genes (DREB3, AITR5 and NF-YA1) were successfully cloned through Gateway Cloning technology, and tomato plants were transformed using Agrobacterium-mediated transformation. Unfortunately, only 2 plants (DREB3 and AITR5) were successfully transformed. T1 plants selected under kanamycin pressure showed a healthy phenotype as wild type, at least under normal growing conditions. To our knowledge, this is the first study correlating transcriptomic data with priming-induced drought tolerance in citrus.

Lo stress idrico è uno dei fattori ambientali più critici, causa di perdite agricole imprevedibili in tutto il mondo, soprattutto in regioni semi-aride come il sud Italia e la Spagna, dove vengono coltivati gli agrumi. Lo stress idrico innesca l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), provocando uno stress ossidativo secondario nelle cellule vegetali. Il priming è un processo in cui le piante, dopo essere state esposte a lievi stress o trattamenti chimici, migliorano la loro capacità di rispondere più efficacemente agli stress futuri, aumentando sia la resilienza che la tolleranza. I portainnesti resilienti agli stress abiotici sono una strategia ampiamente utilizzata per migliorare la tolleranza alla siccità in molte specie vegetali, compresi gli agrumi. Questo progetto mira a valutare gli effetti del priming indotto da nitroprussiato di sodio (SNP) sulle piante di agrumi soggette a stress idrico. La ricerca iniziale si è concentrata sui cambiamenti fisiologici e sui riarrangiamenti trascrittomici in due portainnesti di agrumi (Carrizo citrange e Bitters C22) esposti a siccità indotta da PEG. I livelli di stress sono stati valutati misurando il contenuto di malonil-dialdeide (MDA) e perossido di idrogeno (H₂O₂) nelle foglie, seguiti dal sequenziamento dell'RNA e dall'assemblaggio de novo. L'analisi Weighted Gene Correlation Network Analysis (WGCNA) è stata utilizzata per collegare l'espressione genica ai livelli di MDA e H₂O₂. L'ispezione visiva delle piante e i contenuti di MDA e H₂O₂ indicano chiaramente che Bitters è più tollerante di Carrizo allo stress da siccità indotto da PEG. L'RNA-Seq e WGCNA ha identificato fattori di trascrizione significativamente correlati ai livelli di MDA e H₂O₂ in Carrizo, selezionati come geni candidati per la tolleranza alla siccità. Successivamente, sono stati valutati gli effetti del SNP- priming su piante di agrumi soggette a stress idrico. Gli effetti del priming sono stati valutati su Bitters C22 soggetto a scarsità d'acqua, in quanto più promettente di Carrizo in termini di tolleranza alla siccità. Le piante di Bitters C22 trattate con priming hanno mostrato una tolleranza significativamente maggiore alla siccità rispetto a quelle non trattate. L'RNA-seq ha rivelato che il priming, seguito da stress idrico, ha regolato un ampio spettro di risposte allo stress, migliorando l'efficienza fotosintetica, riallocando l'energia e rinforzando le barriere esterne e i vasi xilematici. Inoltre, la regolazione dell'auxina è stata attivata, mentre le vie dell'etilene sono state represse. Infine, tre geni candidati sono stati caratterizzati funzionalmente tramite espressione ectopica in piante di pomodoro. I geni candidati (DREB3, AITR5 e NF-YA1) sono stati clonati con successo mediante la tecnologia Gateway Cloning, e le piante di pomodoro sono state trasformate utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium. Purtroppo, solo 2 piante (DREB3 e AITR5) sono state trasformate con successo. Le piante T1 selezionate sotto pressione di kanamicina hanno mostrato un fenotipo sano come il wild type, almeno in condizioni di crescita normali. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che collega i dati trascrittomici alla tolleranza alla siccità indotta dal priming negli agrumi.