Modulation of CD8 T cell effector functions and expansion potential through CRISPR-Cas9 gene editing

Cytotoxic CD8 T lymphocytes recognize and eliminate cells presenting non self-antigens, including infected and neoplastic cells. In light of this function, they represent the backbone of current successful adoptive T cell therapies based on redirecting patients' T cells through recombinant T cell receptors (TCRs) to fight cancer and chronic infections. The success of these therapies depends on selecting high-affinity TCRs targeting viral or tumor antigens, along with ensuring the long-term persistence and functionality of the transferred T cells into the patient. However, unbiased methods for TCR isolation based on ex vivo T cell stimulation with antigen-pulsed antigen presenting cells followed by single cell cloning often face challenges in culturing and characterizing CD8 T cell clones, particularly when these cells derive from senescent or exhausted populations with limited proliferative capacity. Additionally, achieving a durable response is often hindered by low in vivo persistence due to the onset of T cell exhaustion in the context of tumor and chronic infection environments. To address these issues, we developed a simple and efficient CRISPR-Cas9 knockout pipeline in antigen-specific CD8 T cell clones to investigate the role of key genes in regulating T cell survival, proliferation, and effector functions. With this study, we aimed to identify novel gene-editing targets to improve the ex vivo characterization of antigen-specific CD8 T cells and to potentially enhance the efficacy of adoptive T cell therapies. To achieve this, we targeted three genes—MED12, CBL-B, and RASA2— recently identified via genome-wide CRISPR-Cas9 screening as promising candidates to improve the efficacy of T cell therapies. In addition, we targeted four cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKis) to explore their role in cell cycle regulation upon antigen-driven and homeostatic stimulation. We found that CBL-B knockout modestly enhanced antigen-driven proliferation, MED12 deletion decreased cytotoxicity, and proliferative capacity. Conversely, RASA2 knockout increased cytotoxic functions but also heightened the susceptibility to activation-induced cell death of CD8 T cells at high antigen doses, leading to defective in vitro growth. Notably, we identified the CDKi p16INK4A as a critical non-redundant regulator of CD8 T cell expansion. Deletion of p16INK4A significantly boosted antigen-driven and homeostatic proliferation, allowing for dramatic expansion of CD8 T cell clones in vitro. Additionally, we proved that p16INK4A is not involved in controlling CD8 T cell effector functions, as its deletion did not affect cytotoxicity and cytokine release. Collectively, with this study, we provided new insights into the basic immunological functions of some factors that control T cell activation and expansion. Our results suggest that p16INK4A deletion may be potentially exploited as a tool to facilitate antigen-specific T cell isolation and characterization in vitro, and potentially improving TCR discovery methods. Additionally, given the established role of p16INK4A in controlling T cell senescence and dysfunction, it may be considered as a potential gene editing target to enhance the long-term efficacy of adoptive T cell therapies, however deeper in vivo characterization studies are required to prove its safety and efficacy.

I linfociti T citotossici CD8 riconoscono ed eliminano cellule che presentano antigeni non self, incluse quelle infette o neoplastiche. Data questa funzione, esse rappresentano il fulcro delle attuali terapie adottive a base di cellule T fondate sul reindirizzamento delle cellule T dei pazienti per combattere il cancro e le infezioni croniche. Il successo di queste terapie dipende dalla selezione di recettori delle cellule T (TCR) ad alta affinità contro antigeni virali o tumorali rilevanti, e dalla capacità di mantenere la persistenza e funzionalità a lungo termine delle cellule T trasferite nel paziente. Tuttavia, i metodi per l’identificazione dei TCR basati sulla stimolazione ex vivo delle cellule T seguite dalla clonazione a singola cellula spesso incontrano difficoltà nella coltura e caratterizzazione dei cloni T CD8, specialmente quando essi derivano da popolazioni senescenti o esauste con una capacità proliferativa limitata. Inoltre, il raggiungimento di una risposta duratura nel paziente è spesso ostacolato dalla bassa persistenza in vivo, a causa dell’insorgere di un fenomeno chiamato “esaurimento” nel contesto di tumori e infezioni croniche. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo per effettuare il knockout di geni tramite CRISPR-Cas9 in cloni CD8 antigene-specifici, per indagare il ruolo di geni chiave nella regolazione della sopravvivenza, proliferazione e funzioni effettrici delle cellule T. Questo studio ha lo scopo di individuare geni bersaglio la cui modificazione tramite delezione genetica permetta di migliorare la caratterizzazione ex vivo delle cellule CD8 e potenzialmente migliorare le terapie adottive a base di cellule T. A tal fine, ci siamo focalizzati su tre geni—MED12, CBL-B e RASA2—recentemente identificati tramite CRISPR-Cas9 knockout screening effettuati su tutto il genoma come candidati promettenti per migliorare le terapie a base di cellule T. Inoltre, ci siamo focalizzati anche sugli inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti (CDKi) per investigare il loro ruolo nella regolazione del ciclo cellulare durante la stimolazione antigenica e omeostatica. Il knockout di CBL-B ha portato ad un modesto aumento della proliferazione antigene dipendente, la delezione di MED12 ha ridotto la citotossicità e la capacità proliferativa, mentre il knockout di RASA2 ha incrementato le funzioni citotossiche dei cloni CD8 testati. Tuttavia, la delezione di RASA2 ha anche incrementato la suscettibilità alla morte cellulare indotta dall'attivazione a dosi elevate di antigene, portando a una ridotta crescita in vitro dei cloni CD8. In particolare, abbiamo identificato il CDKi p16INK4A come un regolatore critico e non ridondante dell'espansione delle cellule T CD8. La delezione di p16INK4A ha potenziato la proliferazione antigene dipendente e quella omeostatica, permettendo una massiccia espansione dei cloni CD8 in vitro. Inoltre, abbiamo dimostrato che p16INK4A non è coinvolto nel controllo delle funzioni effettrici delle cellule T CD8, poiché la sua delezione non ha influenzato la citotossicità e il rilascio di citochine. In conclusione, con questo studio abbiamo fornito nuove informazioni sulle funzioni immunologiche di base di alcuni fattori che controllano l'attivazione e l'espansione delle cellule T. Questi risultati suggeriscono che la delezione di p16INK4A potrebbe essere sfruttata come strumento per facilitare l'isolamento e la caratterizzazione ex vivo delle cellule T antigene specifiche, potenzialmente migliorando i metodi di scoperta di TCR rilevanti. Inoltre, dato il ruolo consolidato di p16INK4A nel controllo della senescenza e disfunzione delle cellule T, la sua delezione tramite editing genetico potrebbe essere considerata come una strategia per migliorare l'efficacia a lungo termine delle terapie adottive a base di cellule T, tuttavia sono necessari studi di caratterizzazione in vivo più approfonditi per dimostrarne la sicurezza e l'efficacia.