Dissecting the role of the HMGB1-CXCL12-CXCR4 axis in Malignant Mesothelioma: From mechanisms to cancer therapeutics

Malignant mesothelioma (MM) is a highly aggressive and incurable malignancy. Its onset is caused by asbestos inhalation which damages mesothelial cells and results in a vicious cycle of cell death and inflammation promoting malignant transformation. Its onset is associated with the release of the nuclear protein high mobility group box 1 (HMGB1) from dying mesothelial cells where it acts as a damage associated molecular pattern. On the cell surface HMGB1 forms a heterocomplex with its cognate ligand CXCL12, which recruits inflammatory cells by activating their chemokine receptor CXCR4. However, the role of the HMGB1-CXCL12-CXCR4 axis is poorly understood in MM. CXCR4 exists on the cell surface as monomers, dimers, and higher order multimers, which dictates receptor functioning and dynamics. CXCR4 can also bind the “don’t-eat-me” signal CD47 on the tumor cell surface, facilitating immune evasion. Recently, in a mouse model of MM, engagement of CXCR4 with the anti-inflammatory fragment of HMGB1 (BoxA) induced the co-internalisation of CXCR4 with CD47, leading to tumor cell phagocytosis by macrophages in vitro and tumor suppression and survival in vivo. The authors called this newly discovered anti-tumor immunosurveillance mechanism ImmunoGenic Surrender (IGS). This thesis draws from a set of integrative structural biology experiments to show the heterocomplex physically interacts with CXCR4, forming a ternary complex on the cell surface which is, in part, mediated by the acidic intrinsically disordered region of HMGB1. The presence of the heterocomplex effects the number of CXCR4 homo-multimerization, which correlates with cell migration. Inhibition of heterocomplex formation can be achieved with the non-steroidal anti-inflammatory drug Diflunisal (DFL), which is also capable of reducing the number of CXCR4 homo-multimers on the MM cell surface. In turn, this releases the contacts between CXCR4 and CD47 on the cell surface, leading to tumor cell phagocytosis by macrophages in vitro, making DFL a potential IGS inducer. It was then of interest to understand whether CXCR4 homo-multimerization is essential for the cell surface contacts between CXCR4 and CD47. To answer this, I generated MM cells expressing mutant constructs of CXCR4 that either cannot oligomerize or cannot internalise. My data suggest that the contacts between CXCR4 and CD47 are favoured when CXCR4 is capable of forming homo-multimers, and that CXCR4 internalization is not essential to break these cell surface contacts. Finally, these in vitro results were then translated in vivo, demonstrating that DFL promotes favourable outcomes in mice inoculated with MM, delaying tumor development, and promoting tumor rejection. Moreover, I show that DFL is capable of synergizing with immune checkpoint inhibitors and can enter the tumor microenvironment when administered orally, making it an attractive molecule for clinical translation. Taken together, the data presented within this thesis answer outstanding questions regarding the appearance and role of the HMGB1-CXCL12-CXCR4 axis on the tumor cell surface. These findings were translated in vivo showing promise for future cancer therapeutics via targeting of this axis.

Il mesotelioma maligno (MM) è una neoplasia altamente aggressiva e incurabile. Il suo insorgere è causato dall’inalazione di amianto, che danneggia le cellule mesoteliali e innesca un circolo vizioso di morte cellulare e infiammazione, favorendo la trasformazione in maligno. Questo processo è associato al rilascio della proteina nucleare high mobility group box 1 (HMGB1) da parte delle cellule mesoteliali in fase di morte, dove agisce come damage associated molecular pattern. Sulla superficie cellulare, HMGB1 forma un eterocomplesso con il suo ligando CXCL12, che recluta cellule infiammatorie tramite l’attivazione del recettore delle chemochine CXCR4. Tuttavia, il ruolo del complesso HMGB1-CXCL12-CXCR4 è poco compreso nel contesto del MM. CXCR4 è presente sulla superficie cellulare sotto forma di monomeri, dimeri e multimeri, determinando il funzionamento e la dinamica del recettore. CXCR4 può anche legarsi al segnale “don’t-eat-me” CD47 sulla superficie delle cellule tumorali, facilitando l’evasione immunitaria. Recentemente, in un modello murino di MM, l’interazione di CXCR4 con il frammento antinfiammatorio di HMGB1 (BoxA) ha indotto la co-internalizzazione di CXCR4 con CD47, portando alla fagocitosi delle cellule tumorali da parte dei macrofagi in vitro, alla soppressione del tumore e alla sopravvivenza in vivo. Gli autori hanno definito questo nuovo meccanismo di immunosorveglianza antitumorale come ImmunoGenic Surrender (IGS). Questa tesi si basa su una serie di esperimenti di biologia strutturale integrativa per dimostrare che l’eterocomplesso interagisce fisicamente con CXCR4, formando un complesso ternario sulla superficie cellulare, mediato in parte dalla regione acida intrinsecamente disordinata di HMGB1. La presenza dell’eterocomplesso influisce sul numero di multimeri omologhi di CXCR4, il che è correlato alla migrazione cellulare. L'inibizione della formazione dell'eterocomplesso può essere ottenuta con il farmaco antinfiammatorio non steroideo Diflunisal (DFL), che è anche in grado di ridurre il numero di multimeri omologhi di CXCR4 sulla superficie delle cellule MM. Di conseguenza, si rompe il legame tra CXCR4 e CD47 sulla superficie cellulare. Questo porta alla fagocitosi delle cellule tumorali da parte dei macrofagi in vitro, rendendo DFL un potenziale induttore di IGS. Mi sono quindi chiesto se la multimerizzazione omologa di CXCR4 fosse essenziale per il legame tra CXCR4 e CD47. Per rispondere a questa domanda, ho generato cellule MM che esprimono costrutti mutanti di CXCR4, incapaci di oligomerizzare o di internalizzarsi. I miei dati suggeriscono che il legame tra CXCR4 e CD47 è favorito quando CXCR4 è in grado di formare multimeri omologhi e che l'internalizzazione di CXCR4 non è essenziale per rompere il legame. Infine, questi risultati in vitro sono stati replicati in vivo, dimostrando che DFL, nei topi inoculati con MM, ritarda lo sviluppo del tumore e ne favorisce il rigetto. Inoltre, ho dimostrato che DFL è in grado di sinergizzare con inibitori dei checkpoint immunitari e può entrare nel microambiente tumorale se somministrato per via orale, rendendolo una molecola interessante nell’applicazione clinica. Complessivamente, i dati presentati in questo lavoro di tesi chiariscono la struttura e il ruolo del complesso HMGB1-CXCL12-CXCR4 sulla superficie delle cellule tumorali. Questi risultati sono stati replicati in vivo, mostrando un potenziale per futuri trattamenti antitumorali grazie al targeting di questo complesso.