Unveiling structural and functional diversity of glycoside hydrolases from extremophilic microorganisms

Extreme environments are characterised by harsh conditions along with a scarcity of available nutrients. These environments are populated by the so-called extremophilic organisms that evolved a plethora of strategies to thrive in these extreme conditions. Terrestrial and marine polysaccharides are the main carbon and energy sources in extreme environments. The mechanisms by which extremophilic organisms degrade polysaccharides and the enzymes involved in this process remain mostly unexplored so far. A central role in the polysaccharides degradation is played by glycoside hydrolases (GHs), that hydrolyse glycosidic bonds in oligo and polysaccharides. The initial section of this Thesis is dedicated to the characterisation of GHs identified in the genome of two psychrophilic bacteria, namely Marinomonas sp. ef1 and Pseudomonas sp. ef1, which are part of the microbial consortium of Euplotes focardii, an Antarctic marine ciliate. More in detail, this section focuses on the role of enzymes belonging to the GH3 family (M_GH3A and M_GH3B) in the sugar metabolism of Marinomonas sp. ef1, as well as the role of putatively secreted enzymes belonging to the GH5 and GH50 families, identified in the genome of Pseudomonas sp. ef1, in the degradation of marine and terrestrial polysaccharides. Both experimental and computational data indicate that M_GH3A is a β-glucosidase active on cellulose-derived oligosaccharides, such as cellobiose and cellotetraose. In contrast, M_GH3B is an exotype β-xylanase involved in the hydrolysis of xylan- and arabinoxylan-derived oligosaccharides. Ps_GH5 and Ps_GH50 are situated within unexplored regions of their sequence space, representing two hitherto unidentified subfamilies of GH5 and GH50. The biochemical characterisation of the recombinant enzymes points out that Ps_GH5 is an endo-type β-xylanase, while Ps_GH50 displays activity towards short-chain galacto-oligosaccharides. In conclusion, the characterisation of these enzymes has elucidated their physiological roles in the metabolism and adaptation of two Antarctic bacteria belonging to the same microbial consortium. The second section of this Thesis deals with the ability of the halotolerant bacterium Bacillus altitudinis strain CM4 to grow on xylan from beechwood as the sole carbon and energy source. This endophytic bacterium was isolated from the leaves of Cakile maritima, a plant found in the coastal environment of Crete. The combined action of two putatively secreted GHs belonging to the GH11 and GH30 families results in the efficient degradation of xylan. In particular, BaGH30 is an endo-β-xylanase that hydrolyses xylan to medium-chain xylo-oligosaccharides, which were subsequently depolymerised to xylose and xylobiose by the action of the exo-type β-xylosidase BaGH11. In conclusion, this thesis provides new insights into the role of GHs in the adaptation to extreme environments and paves the way for the exploitation of these enzymes in the treatment of hemicellulosic biomasses. Overall, extremophilic organisms are revealed to be a goldmine of GHs with peculiar structural and functional features, highlighting the importance of these organisms in enzyme discovery.

Gli ambienti estremi sono caratterizzati da condizioni difficili e da scarsità di nutrienti disponibili. Questi ambienti sono popolati dai cosiddetti organismi estremofili, che hanno sviluppato una moltitudine di strategie per prosperare in queste condizioni estreme. I polisaccaridi terrestri e marini sono le principali fonti di carbonio ed energia negli ambienti estremi. I meccanismi con cui gli organismi estremofili degradano i polisaccaridi e gli enzimi coinvolti in questo processo rimangono per lo più inesplorati fino ad oggi. Un ruolo centrale nella degradazione dei polisaccaridi è svolto dalle glicoside idrolasi (GH), che idrolizzano i legami glicosidici in oligo e polisaccaridi. La sezione iniziale di questa tesi è dedicata alla caratterizzazione delle GH identificate nel genoma di due batteri psicrofili, cioè Marinomonas sp. ef1 e Pseudomonas sp. ef1, che fanno parte del consorzio microbico di Euplotes focardii, un ciliato marino antartico. Più in dettaglio, questa sezione si concentra sul ruolo degli enzimi appartenenti alla famiglia GH3 (M_GH3A e M_GH3B) nel metabolismo degli zuccheri di Marinomonas sp. ef1, così come sul ruolo degli enzimi presumibilmente secreti appartenenti alle famiglie GH5 e GH50, identificati nel genoma di Pseudomonas sp. ef1, nella degradazione dei polisaccaridi marini e terrestri. Sia i dati sperimentali che computazionali indicano che M_GH3A è una β-glucosidasi attiva sugli oligosaccaridi derivati dalla cellulosa, come cellobiosio e cellotetraosio. Al contrario, M_GH3B è una β-xilanasi di tipo eso coinvolta nell'idrolisi di oligosaccaridi derivati da xilano e arabinoxilano. Ps_GH5 e Ps_GH50 si trovano in regioni inesplorate del loro spazio di sequenza, rappresentando due sottofamiglie finora non identificate di GH5 e GH50. La caratterizzazione biochimica degli enzimi ricombinanti evidenzia che Ps_GH5 è una β-xilanasi di tipo endo, mentre Ps_GH50 mostra attività verso galatto-oligosaccaridi a catena corta. In conclusione, la caratterizzazione di questi enzimi ha chiarito i loro ruoli fisiologici nel metabolismo e nell'adattamento di due batteri antartici appartenenti allo stesso consorzio microbico. La seconda sezione di questa tesi tratta della capacità del batterio alotollerante Bacillus altitudinis ceppo CM4 di crescere su xilano derivato da legno di faggio come unica fonte di carbonio ed energia. Questo batterio endofitico è stato isolato dalle foglie di Cakile maritima, una pianta presente nell'ambiente costiero di Creta. L'azione combinata di due GH presumibilmente secreti appartenenti alle famiglie GH11 e GH30 porta alla degradazione efficiente dello xilano. In particolare, BaGH30 è una endo-β-xilanasi che idrolizza lo xilano in oligosaccaridi xilosi a catena media, i quali sono successivamente depolimerizzati in xilosio e xilobiosio grazie all'azione della β-xilosidasi di tipo eso BaGH11. In conclusione, questa tesi fornisce nuove intuizioni sul ruolo delle GH nell'adattamento agli ambienti estremi e apre la strada all'utilizzo di questi enzimi nel trattamento delle biomasse emicellulosiche. Complessivamente, gli organismi estremofili si rivelano essere una miniera d'oro di GH con caratteristiche strutturali e funzionali peculiari, evidenziando l'importanza di questi organismi nella scoperta di nuovi enzimi.