Computational study on the bioluminescence of the NanoLuc-Furimazine system

The study of bioluminescence, a fascinating natural phenomenon, has generated a fervent scientific interest because of its various biological functions and potential applications in many different fields like chemical biology, imaging, and therapeutic procedures. This thesis work focuses on unravelling the bioluminescent mechanism of the NanoLuc-furimazine system, a luciferase-luciferin pair that recently became popular and widespread in bioanalytical applications due to its outstanding brightness and stability, but whose molecular processes are still unclear. Section 1 revolves around bioluminescence diffusion, evolution and role in the natural reigns, including a detailed description of the most popular luciferin-luciferase systems and their applications. The role of computational chemistry in the struggle to get deeper insights of the mechanisms underlying their bioluminescence is then introduced, as well as NanoLuc-furimazine pair main features and characteristics, with a particular emphasis on the obscure aspects of its light emitting process. Section 2 gives a small-scale cross-section of the state of the art of different computational methods, including molecular mechanics, molecular dynamics, docking calculations, and quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) approaches, which were all applied to model the system of interest. In the subsequent third section, then, the results of the research project are reported, with a three-parted structure. Section 3.1 main focus is modeling of NanoLuc-furimazine and NanoLuc-furimamide complexes to identify the most likely protonation states of furimazine, the reactant of the catalytic process, and furimamide, the final emissive product. The results revealed that the relative stability of the enol and keto forms of furimazine in aqueous solutions are compatible with the involvement of the former in the bioluminescent reaction. Basing on this hypothesis, the zwitterionic form of furimamide (FurC) emerged as the most probable final product, with its emission spectrum being the best fitting one with respect to experimental data. Even if the anionic form (FurD) was shown to have a quite fitting emission spectrum, it is less likely to be the culprit of the bright light deriving from NanoLuc activity due to its high protonation tendency. Section 3.2 reports the spectroscopic characterization of furimazine and furimamide in polar solvents, combining UV/Vis and NMR spectroscopy, which was carried out to further support the involvement of the enol form as substrate of the NanoLuc catalytic cycle and check the exclusion of FurD from the pool of possible emitters. Experimental findings point at the predominance of the enol tautomer of furimazine in polar solvents such as dimethyl sulfoxide, which is consistent with the results obtained from quantum mechanical calculations. The observed extreme resistance of neutral furimamide (FurA) to deprotonation, then makes it possible to reasonably state that FurC, rather than FurD, is the primary emissive species. Section 3.3 investigates the oxidation mechanism of furimazine, focusing on the formation and decomposition of the dioxetanone intermediate, a crucial species in the reaction, whose chemiluminescent decomposition accounts for many bioluminescent systems emission. Two possible pathways for furimazine oxidation, at the C2 and C3 positions, were explored, both of which are feasible, with energy barriers suggesting that C2 oxygenation is the more favourable one. The subsequent decomposition of dioxetanone was studied for three protonation states (being the precursors of FurA, FurC, and FurD), revealing insights into the mechanism by which these products may form. All the results obtained are then summarized in the final section, to help delineating a comprehensive picture of the NanoLuc-furimazine system.

Lo studio della bioluminescenza, un affascinante fenomeno naturale, ha suscitato un intenso interesse scientifico grazie alle sue molteplici funzioni biologiche e alle potenziali applicazioni in vari campi, come la biologia chimica, l’imaging e le procedure terapeutiche. Questo lavoro di tesi si concentra sullo studio del meccanismo bioluminescente del sistema NanoLuc-furimazina, una coppia luciferasi-luciferina che ha recentemente guadagnato popolarità nelle applicazioni bioanalitiche grazie alla sua straordinaria luminosità e stabilità, sebbene i suoi processi molecolari restino ancora poco chiari. La Sezione 1 esplora la diffusione, l’evoluzione e il ruolo della bioluminescenza nei regni naturali, includendo una descrizione dettagliata dei sistemi luciferasi-luciferina più diffusi e delle loro applicazioni. Viene quindi introdotto il ruolo giocato dalla chimica computazionale nell'approfondire i meccanismi alla base della bioluminescenza, insieme alle caratteristiche principali della coppia NanoLuc-furimazina, con particolare enfasi sugli aspetti ancora oscuri del suo processo di emissione luminosa. La Sezione 2 fornisce una panoramica delle principali tecniche computazionali, tra cui meccanica molecolare, dinamica molecolare, calcoli di docking e approcci ibridi QM/MM, tutti applicati per modellare il sistema di interesse. Nella terza sezione vengono poi riportati i risultati del progetto di ricerca, articolati in tre parti. La Sezione 3.1 è focalizzata sulla modellazione dei complessi NanoLuc-furimazina e NanoLuc-furimamide, per identificare gli stati di protonazione più probabili della furimazina, il reagente del processo catalitico, e della furimamide, il prodotto finale emissivo. I risultati hanno rivelato che la stabilità relativa delle forme enolica e chetonica della furimazina in soluzioni acquose è compatibile con il coinvolgimento della prima nella reazione bioluminescente. Sulla base di questa ipotesi, la forma zwitterionica della furimamide (FurC) è emersa come il prodotto finale più probabile, con uno spettro di emissione che si adatta meglio ai dati sperimentali. Sebbene la forma anionica (FurD) mostri uno spettro di emissione abbastanza simile, è meno probabile che sia la responsabile dell’intensa emissione luminosa della NanoLuc a causa della sua elevata tendenza alla protonazione. La Sezione 3.2 riporta la caratterizzazione spettroscopica di furimazina e furimamide in solventi polari, combinando spettroscopia UV/Vis e NMR, condotta per supportare ulteriormente l’impiego della forma enolica come substrato del ciclo catalitico di NanoLuc e verificare l’esclusione di FurD dal pool dei possibili emettitori. I risultati sperimentali indicano la predominanza del tautomero enolico della furimazina in solventi polari come il dimetilsolfossido, in linea con i risultati ottenuti dai calcoli quantomeccanici. L’estrema resistenza alla deprotonazione della furimamide neutra (FurA) consente quindi di affermare ragionevolmente che FurC, piuttosto che FurD, sia la specie primaria emissiva. La Sezione 3.3 esplora il meccanismo di ossidazione della furimazina, con particolare attenzione alla formazione e decomposizione dell’intermedio diossetanone, una specie cruciale nella reazione, la cui decomposizione chemiluminescente è responsabile dell’emissione luminosa in molti sistemi bioluminescenti. Sono stati esplorati due possibili percorsi di ossidazione della furimazina, nelle posizioni C2 e C3, entrambi plausibili, con barriere energetiche che indicano che l’ossigenazione in C2 è la più favorevole. La successiva decomposizione del diossetanone è stata studiata per tre stati di protonazione (precursori di FurA, FurC e FurD), rivelando dettagli sul meccanismo di formazione di questi prodotti. Tutti i risultati ottenuti sono quindi riassunti nella sezione finale, per aiutare a delineare un quadro complessivo del sistema NanoLuc-furimazina.