STUDY OF THE POTENTIAL NEUROPROTECTIVE EFFECT OF AMBROXOL DRUG IN AUTOPHAGY MECHANISMS IN AN IN VITRO MODEL OF PARKINSON'S DISEASE

Parkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative disorders. PD is characterized by a gradual loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra, due to the presence of neurites and Lewy bodies, mainly composed by the pathological hallmark alpha-synuclein (αSyn), within the degenerating neurons. Patients with PD exhibit both motor (tremor, rigidity, hypokinesia) and non-motor (neuropsychiatric disturbances, psychosis, behavior and mood alterations, sleep disorders and others) symptoms. Symptoms of PD negatively affect daily PD-patients life. As symptoms start to arise when 50–70% of neurons have been lost. Currently, diagnosis is only possible at an advanced stage of the disease and PD cannot be cured, but several medications can help control the symptoms. According to the literature, the presence of misfolded protein aggregates into the neurons is a basic requirement for the neurodegenerative process and dysfunctions of the protein catabolic systems play a crucial role in PD. Recently in vitro and in vivo studies have reported that ambroxol, a drug used as treatment for respiratory diseases, is able to increase β-glucocerebrosidase lysosomal enzyme activity and to reduce αSyn levels. Our aims are to investigate alterations of extracellular and intracellular αSyn levels after exposure to negative stimuli (KCl, NH4Cl, H2O2 and rotenone) and assess the potential neuroprotective effect of ambroxol, in basal and stress conditions, in order to correct dysfunctions of catabolic pathways ( macroautophagy and chaperone-mediated autophagy CMA). Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were exposed to different concentrations and exposure times of selected negative stimuli (KCl, NH4Cl, H2O2 and rotenone), ambroxol or both. Protein and gene levels of αSyn and targets involved in αSyn clearance were quantified by Western-blot (WB) and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and extracellular protein release by Dot blot (DB). We designed a preventive protocol of 2 days 60 μM-ambroxol exposure, followed by 24 hours of co-stimulation with negative stimuli. We found that oxidative stress caused by H2O2, and rotenone enhanced extracellular levels of αSyn. Ambroxol, in basal condition: 1) enhanced the intracellular level of both monomeric and oligomeric αSyn forms starting from 48 exposure hours; 2) decreased extracellular protein levels of LAMP1, a lysosomal marker; 3) increased intracellular protein levels of LAMP1, and p62, a macroautophagy substrate, with no changes in other macroautophagy (beclin-1, LC3-II) and CMA (LAMP2A, HSC70) effectors; 4) did not affect gene expression of all investigated parameters and extracellular αSyn release. Ambroxol, in stress condition: 1) decreased the induced extracellular increase of both αSyn and LAMP1 protein levels; 2) decreased the level of intracellular 50 kDa oligomeric αSyn protein. The previously described protocol was applied to non-tumoral cells represented by neonatal rat neurons, to validate the results obtained in neuroblastoma cells. Obtained results from WB analyzes denote that 72 hours ambroxol exposure significantly increased the monomeric form of αSyn and enhanced the level of macroautophagic targets p62 and LC3-II, both under basal conditions and especially in the presence of the negative stimuli. The obtained data suggest that ambroxol under basal conditions improves cellular homeostasis by increasing levels of physiological αSyn, decreases exocytosis in favor of lysosomal biogenesis (decreased extracellular and increased intracellular levels of LAMP1) and enhances macroautophagy pathway by increasing levels of p62. Ambroxol is able to counteract the effects of negative stimuli by decreasing αSyn pathological levels. Results obtained by evaluation of protein of cortical rat cell (increased levels of p62) confirm the key role of ambroxol in macroautophagy pathway.

Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa. Il PD è caratterizzato da una graduale perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra, dovuta alla presenza di neuriti e corpi di Lewy, composti principalmente dalla caratteristica patologica alfa-sinucleina (aSyn), all'interno dei neuroni in degenerazione. I pazienti PD presentano sia sintomi motori che non motori. I sintomi del PD influenzano negativamente la vita quotidiana dei pazienti con PD. Attualmente, la diagnosi è possibile solo in una fase avanzata della malattia e il PD non può essere curato, ma diversi farmaci possono aiutare a controllare i sintomi. Secondo la letteratura, la presenza di aggregati proteici mal ripiegati nei neuroni è un requisito fondamentale per il processo neurodegenerativo e le disfunzioni dei sistemi catabolici delle proteine svolgono un ruolo cruciale nel PD. Studi in vitro e in vivo hanno recentemente riportato che l'ambroxolo, un farmaco utilizzato come trattamento per le malattie respiratorie, è in grado di aumentare l'attività enzimatica lisosomiale della β-glucocerebrosidasi e di ridurre i livelli di aSyn. I nostri obiettivi sono di indagare le alterazioni dei livelli di aSyn dopo l'esposizione a stimoli negativi (KCl, NH4Cl, H2O2 e rotenone) e valutare il potenziale effetto neuroprotettivo dell'ambroxolo, in condizioni basali e di stress, al fine di correggere le disfunzioni della macroautofagia e del CMA. Le cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sono state esposte a diverse concentrazioni e tempi di esposizione a più stimoli negativi (KCl, NH4Cl, H2O2 e rotenone), ambroxolo o entrambi. I livelli di proteine e geni di aSyn e i target coinvolti nella clearance di aSyn sono stati quantificati tramite Western-blot (WB) e RT-qPCR e il rilascio di proteine extracellulari tramite Dot blot. Abbiamo progettato un protocollo preventivo di 2 giorni di esposizione a 60 μM-ambroxolo, seguiti da 24 ore di co-stimolazione con stimoli negativi. Abbiamo scoperto che lo stress ossidativo causato da H2O2 e rotenone ha aumentato i livelli extracellulari di aSyn. L'ambroxolo, in condizioni basali: 1) ha aumentato il livello intracellulare di entrambe le forme monomeriche e oligomeriche di aSyn a partire da 48 ore di esposizione; 2) ha ridotto i livelli di proteine extracellulari di LAMP1, un marcatore lisosomiale; 3) ha aumentato i livelli di proteine intracellulari di LAMP1 e p62, un substrato della macroautofagia, senza cambiamenti in altri effettori della macroautofagia (beclin-1, LC3-II) e CMA (LAMP2A, HSC70); 4) non ha influenzato l'espressione genica di tutti i parametri studiati e il rilascio extracellulare di aSyn. Ambroxolo, in condizioni di stress: 1) ha ridotto l'aumento extracellulare indotto dei livelli proteici di aSyn e LAMP1; 2) ha ridotto il livello di proteina oligomerica intracellulare aSyn da 50 kDa. Il protocollo precedentemente descritto è stato applicato a cellule non tumorali rappresentate da neuroni di ratto neonatali, per convalidare i risultati ottenuti nelle cellule di neuroblastoma. I risultati ottenuti dalle analisi WB indicano che l'esposizione di 72 ore ad ambroxolo ha aumentato significativamente la forma monomerica di aSyn e migliorato il livello di target macroautofagici p62 e LC3-II, sia in condizioni basali che soprattutto in presenza di stimoli negativi. I dati ottenuti suggeriscono che l'ambroxolo in condizioni basali migliora l'omeostasi cellulare aumentando i livelli di aSyn fisiologica, diminuisce l'esocitosi a favore della biogenesi lisosomiale (livelli extracellulari ridotti e livelli intracellulari aumentati di LAMP1) e potenzia il percorso della macroautofagia aumentando i livelli di p62. L'ambroxolo è in grado di contrastare gli effetti degli stimoli negativi riducendo i livelli patologici di aSyn. I risultati ottenuti dalla valutazione della proteina della cellula corticale di ratto (livelli aumentati di p62) confermano il ruolo chiave dell'ambroxolo nella macroautofagia.