Approfondimento sulle risposte alla coltura ex vivo delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per migliorare terapie geniche e cellulari

Hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy (HSPC-GT) requires ex vivo culture to achieve a sizable fraction of engineered cells. However, despite significant efforts to constantly optimize culture conditions, long-term repopulating hematopoietic stem cells (HSCs) rapidly lose self-renewal potential and differentiate upon ex vivo exposure. Combined with different adverse reactions triggered by genetic engineering, such as the activation of the DNA damage response (DDR) and the formation of genotoxic byproducts, these detrimental responses may jeopardize the efficacy and safety of the therapy by delaying hematopoietic reconstitution and affecting the clonal repertoire of repopulating stem cells. Here, we discovered that ex vivo culture inadvertently leads to p38 MAPK activation, generating mitogenic reactive oxygen species (ROS) that fuel fast cell cycle progression, causing proliferative stress with accumulation of physical DNA damage and consequent activation of the DDR. Importantly, transient p38 inhibition was sufficient to mitigate the activation of this intricate molecular axis, endowing Cas9/AAV6-edited HSPCs with superior long-term hematopoietic reconstitution and polyclonal output upon transplant. Alongside p38 MAPK activation, we reasoned that additional detrimental responses may arise from HSPC removal from the hypoxic bone marrow niche and be exacerbated by the absence of 3D stimuli and mechanical support in traditional 2D cultures. Thus, we tested a biocompatible 3D scaffold with cell scale resolution, which increased ex vivo cultured HSPC functionality. By performing transcriptomic analyses, we found upregulation of genes belonging to cytoskeleton organization and adhesion, with concomitant downregulation of DNA damage and DDR, replication and cell division, transcription, protein homeostasis, and oxidative respiration, features associated with more primitive and dormant stem cells. Mechanistically, 3D scaffolds prevented HSPC deformation and squashing occurring in traditional 2D culture, conserving nuclei morphology and tubulin polarity. Moreover, 3D scaffolds ameliorated HSPC functionality upon multiple genetic engineering strategies, including Cas9/AAV6, base- and prime-editing, and lentiviral gene addition, increasing the number of engrafting clones and the long-term persistence of edited cells in secondary transplantation experiments. Similar results were obtained when implementing our 3D scaffolds into the clinically approved GT protocol for Wiskott-Aldrich Syndrome using patient-derived samples. Overall, our results highlight innovative strategies to preserve HSPC functionality during ex vivo manipulation for more effective and safer therapeutic applications.

La terapia genica con cellule staminali e progenitrici emopoietiche richiede coltura ex vivo per ottenere una frazione considerevole di cellule ingegnerizzate. Tuttavia, nonostante vari sforzi per ottimizzare costantemente le condizioni di coltura, le cellule staminali emopoietiche, che ripopolano a lungo termine il sistema ematopoietico, perdono rapidamente il loro potenziale di rigenerazione e si differenziano in seguito all'esposizione di colture ex vivo. In combinazione con diverse reazioni avverse innescate dall'ingegneria genetica, come l'attivazione della risposta al danno del DNA e la formazione di sottoprodotti genotossici, queste risposte dannose possono compromettere l'efficacia e la sicurezza della terapia, ritardando la ricostituzione emopoietica e riducendo il numero di cloni che ripopolano il sistema ematopoietico. In questo lavoro, abbiamo scoperto che la coltura ex vivo porta inavvertitamente all'attivazione di p38 MAPK, generando specie reattive dell'ossigeno che sono principalmente mitogeniche e alimentano una rapida progressione del ciclo cellulare, causando stress proliferativo con accumulo di danni al DNA e conseguente attivazione della risposta al danno del DNA. In più, abbiamo scoperto che l'inibizione transitoria di p38 è stata sufficiente a mitigare l'attivazione di questo intricato asse molecolare, dotando le HSPC modificate da Cas9/AAV6 di una ricostituzione ematopoietica a lungo termine superiore con un maggior numero di cloni dopo il trapianto. Insieme all'attivazione di p38 MAPK, abbiamo pensato che ulteriori risposte dannose potrebbero derivare dalla rimozione delle cellule dalla nicchia ipossica del midollo osseo ed essere esacerbate dall'assenza di stimoli 3D e supporto meccanico nelle colture 2D tradizionali. Pertanto, abbiamo testato una matrice 3D biocompatibile di dimensioni su scala cellulare, che ha aumentato la funzionalità delle cellule coltivate ex vivo. Eseguendo analisi trascrittomiche, abbiamo riscontrato una maggior espressione di geni appartenenti all'organizzazione del citoscheletro e all'adesione cellulare, con concomitante ridotta espressione del danno al DNA e delle risposte ad esso, replicazione e divisione cellulare, trascrizione, omeostasi proteica e respirazione ossidativa, tutte caratteristiche associate a cellule staminali più primitive e dormienti. Meccanicisticamente, le matrici 3D hanno impedito la deformazione e lo schiacciamento delle cellule che si verificavano nella tradizionale coltura 2D, conservando la morfologia dei nuclei e la polarità della tubulina. Inoltre, le matrici 3D hanno migliorato la funzionalità delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche su molteplici strategie di ingegneria genetica, tra cui Cas9/AAV6, base- e prime-editing, e aggiunta di geni tramite lentivirus, aumentando il numero di cloni ripopolanti il sistema ematopoietico e la loro persistenza a lungo termine negli esperimenti di trapianto secondario. Risultati simili sono stati ottenuti quando abbiamo implementato le nostre matrici 3D nel protocollo di terapia genica approvato in clinica per la sindrome di Wiskott-Aldrich utilizzando campioni derivati dai pazienti. In conclusione, i nostri risultati evidenziano strategie innovative per preservare la funzionalità delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche durante la manipolazione ex vivo per applicazioni terapeutiche più efficaci e più sicure.