Evaluation of the efficacy and safety of gene therapy strategies for liver metabolic diseases

Il fegato è un importante organo metabolico coinvolto in molte malattie genetiche. Nel corso degli anni sono state sviluppate come approcci terapeutici strategie di terapia genica dirette al fegato. L'aggiunta di geni basata su vettori virali adeno-associati (AAV) è diventata un farmaco approvato per l’emofilia, patologia ereditaria della coagulazione. Tuttavia, altre strategie per modificare il genoma degli epatociti, come l'editing genetico, sono in fase di sviluppo. Con l'editing genetico basato su CRISPR/Cas9 è possibile ottenere inserimenti mirati di transgeni che sono mantenuti durante la proliferazione degli epatociti. Il mantenimento dei transgeni è fondamentale per il trattamento di disturbi metabolici che hanno una rapida manifestazione e declino. Due di questi disturbi metabolici sono la malattia delle urine a sciroppo d'acero (MSUD) e la colestasi intraepatica familiare progressiva di tipo 2 (PFIC2). MSUD è causata da mutazioni in uno di quattro geni, noi ci stiamo concentrando su DBT, mentre PFIC2 è dovuta a mutazioni in ABCB11. L'editing genetico potrebbe diventare una strategia terapeutica per MSUD e PFIC2, integrando il cDNA del transgene nel primo introne dei geni DBT e ABCB11, rispettivamente, per mantenere il più possibile la regolazione fisiologica. In questo lavoro, abbiamo testato diverse strategie di integrazione e dimostrato che i DNA donatori con bracci di omologia corti sono i più efficienti nell'integrare ed esprimere il transgene. Quindi, abbiamo dimostrato che la co-somministrazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) e AAV risulta nel più alto tasso di integrazione. Tuttavia, per sviluppare l'editing genetico per PFIC2 è importante considerare la fibrosi epatica, che causa alterazioni dell'architettura e del metabolismo del fegato. Qui, abbiamo sfruttato due modelli murini indotti chimicamente e due genetici con diversi tipi e gradi di fibrosi epatica. Riportiamo che sia la fibrosi pericentrale che quella periportale hanno inibito parzialmente il trasferimento genico agli epatociti mediato da vettori lentivirali (LV) e LNP, mentre l'efficienza della trasduzione mediata da AAV è stata ridotta solo in presenza di fibrosi periportale. Il trasferimento genico era meno impattato quando la fibrosi epatica era più lieve. Abbiamo anche studiato la biodistribuzione della trasduzione dei LV nei diversi organi e cellule epatiche e la zonazione nel lobulo epatico del trasferimento genico mediato da LV, AAV e LNP. Nel complesso, questo lavoro dà informazioni sulla strategia ottimale e sulla tempistica dell'editing genomico diretto al fegato per il trattamento di MSUD e PFIC-2 e fa luce sull'impatto della fibrosi epatica sul trasferimento genico agli epatociti.

The liver is a major metabolic organ involved in many genetic diseases. Over the years in vivo liver-directed gene therapy strategies have been developed as therapeutic approaches. Gene addition based on adeno-associated viral vectors (AAVs) has become an approved drug for the inherited coagulation disease hemophilia. However, other strategies, such as gene editing, are being developed to modify the hepatocyte genome. With CRISPR/Cas9-based gene editing it is possible to obtain targeted transgene insertions maintained upon hepatocyte proliferation. Transgene maintenance is fundamental for the treatment of metabolic disorders that have rapid manifestation and decline. Two of these metabolic disorders are Maple syrup urine disease (MSUD) and Progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2). MSUD is caused by mutations in one of four different genes, we are concentrating on DBT, while PFIC2 is due to mutations of ABCB11. Gene editing may become a therapeutic strategy for MSUD and PFIC2, by integrating transgene cDNA in the first intron of DBT and ABCB11 genes, respectively, to maintain as much as possible physiological gene regulation. In this work, we tested different integration strategies and demonstrated that donor DNAs with short homology arms are the most efficient in integrating and expressing the transgene. Then, we showed that the coadministration of lipid nanoparticles (LNPs) and AAVs resulted in the highest integration rate. However, to develop gene editing for PFIC2 it is important to consider liver fibrosis, which causes alteration of liver architecture and metabolism. Here, we exploited two chemically induced and two genetic mouse models with different types and grades of liver fibrosis. We report that both pericentral and periportal fibrosis partially inhibited lentiviral vector (LV) and LNP-mediated hepatocyte gene transfer, while the efficiency of AAV-mediated transduction was reduced only in the presence of periportal fibrosis. Gene transfer was less impacted when liver fibrosis was milder. We also investigated the biodistribution of LV transduction among different organs and liver cell types, and the zonation in the liver lobule of LV-, AAV-, and LNP-mediated gene transfer. Overall, this work informs about the optimal strategy and timeframe of in vivo liver-directed genome editing for the treatment of MSUD and PFIC-2 and sheds light on the impact of liver fibrosis on hepatic gene transfer.