DEFINITION OF MOLECULAR NETWORKS OF ERYTHROPOIESIS AND HEMATOPOIESIS IN BETA-THALASSEMIA

Il compartimento delle cellule staminali ematopoietiche (CSE) è un gruppo eterogeneo che risponde prontamente e dinamicamente all'infiammazione, all'anemia e ad altri stress, adattando così il processo ematopoietico a peculiari esigenze fisiologiche. L’anemia e l’eritropoiesi inefficace insieme al deterioramento del microambiente del midollo osseo (MO) conferiscono alla Beta-talassemia (Btal) caratteristiche di “malattia correlata allo stress”. Tuttavia, non è ancora chiaro il modo in cui l'infiammazione e l'anemia cronica abbiano un impatto sulle CSE primitive, modellando così il loro impegno di lignaggio e il processo emopoietico. Le nostre recenti scoperte hanno rivelato per la prima volta che le CSE Btal hanno un potenziale eritroide potenziato e un profilo trascrittomico ha rivelato un livello di espressione più bassi nei percorsi correlati all'infiammazione coinvolti nel controllo della quiescenza e della differenziazione delle CSE, come la segnalazione del TNFα tramite NFkB. Abbiamo ipotizzato che le condizioni di stress nella nicchia Btal MO (cioè sovraccarico di ferro, accumulo di specie reattive all’ossigeno, espansione del midollo) alterano l'attivazione della via NFkB nelle CSE, migliorando la loro differenziazione preferenziale verso la linea eritroide. Abbiamo trovato una bassa attivazione basale di NFkB p65 nelle CSE di Btal, mentre i progenitori multipotenti (MPP) polarizzati da megacariociti (Mk)/eritroidi (E) (MPPsMk/E) hanno mostrato un'alta attivazione basale, suggerendo il loro ruolo principale nel sostenere l'ematopoiesi. Abbiamo scoperto che il plasma MO di Btal è caratterizzato da un'elevata dose di TNFα e i risultati preliminari hanno supportato il coinvolgimento delle cellule T CD4+, con frequenza maggiore rispetto al controllo, come principali produttori di TNFα. Studi in vitro e in vivo con inibitori del TNFα e NFkB hanno rivelato che le MPPs Mk/E, ma non le CSE Btal, sono le cellule in grado di rispondere a stimoli infiammatori aggiuntivi e una segnalazione deregolamentata di NFkB migliora l'impegno eritroide. È importante sottolineare che i trattamenti in vivo che riducono i livelli di TNFα ripristinano l’equilibrio nel potenziale di differenziazione delle CSE Btal, corroborando così, per la prima volta, il ruolo di questa molecola infiammatoria sul processo differenziativo in una malattia diversa dalla neoplasia ematologica. Il nostro studio fornirà nuove informazioni sul processo ematopoietico in Btal aiutando a sviluppare nuove strategie per preservare la funzionalità delle CSE e ripristinare l'equilibrio dell'impegno ematopoietico, da combinare con l'approccio della terapia genica.

The hematopoietic stem cell (HSC) compartment is an heterogenous pool which promptly and dynamically responds to inflammation, anaemia and other stress, thus adapting the hematopoietic process to peculiar physiological demands. The anaemia and the ineffective erythropoiesis together with the impairment of the bone marrow (BM) microenvironment give to Beta-thalassemia (Bthal) features of ‘stress related disease’. Nevertheless, how inflammation and chronic anaemia have an impact on primitive HSCs, thus shaping their lineage commitment and the hematopoietic process, is still missing. Our recent findings revealed for the first time that Bthal HSCs have an enhanced erythroid potential and transcriptome profile unveiled downregulation in pathways related to inflammation involved in the control of HSC quiescence and differentiation, such as TNFα via-NFkB signalling. We hypothesized that stress conditions in Bthal BM niche (i.e. iron overload, ROS accumulation, marrow expansion) alter the activation of NFkB pathway in HSCs, enhancing their preferential differentiation towards the erythroid lineage. We found low basal NFkB p65 activation in Bthal HSCs, whereas Megakaryocyte (Mk)/Erythroid (E) biased-MPPs (MPPsMk/E) showed an active one, suggesting their major role in sustaining the haematopoiesis. We uncovered that Bthal BM plasma is characterized by high dose of TNFα, and preliminary results supported the involvement of CD4+ T cells, increased in frequency compared to control, as main TNFα producers. In vitro and in vivo studies with TNFα and NFkB inhibitors revealed that MPPsMk/E, but not Bthal HSCs, are the cells able to respond to additional inflammatory stimulus and a deregulated NFkB signalling enhances the erythroid commitment. Importantly, in vivo treatments reducing TNFα levels restores the balance in the differentiation potential of Bthal HSCs, thus corroborating, for the first time, the role of this inflammatory molecule on lineage commitment in a disease different from haematological malignancy. Our study will provide new insights in the hematopoietic process in Bthal helping to develop new strategies to preserve HSC functionality and restore the balance of the hematopoietic commitment, to be combined with gene therapy (GT) approach.