Studi evoluzionistici, biochimici e strutturali su PCYOX1; e studi strutturali su LSD1 ingegnerizzata

Prenylcysteine oxidases (PCYOXs) metabolize prenylated cysteines produced by protein degradation. They utilize oxygen as a co-substrate to produce free cysteine, an aldehyde, and hydrogen peroxide through the unusual oxidation of a thioether bond. In this thesis, I explored the evolution, structure, and mechanism of the two mammalian PCYOXs. A gene duplication event in jawed vertebrates originated in these two paralogs. Both enzymes are active on farnesyl- and geranylgeranylcysteine, but inactive on molecules with shorter prenyl groups. Kinetics experiments outline a mechanism where flavin reduction and re-oxidation occur rapidly without any detectable intermediates, with the overall reaction rate limited by product release. The experimentally determined three-dimensional structure of PCYOX1 reveals long and wide tunnels leading from the surface to the flavin. They allow the isoprene substrate to curl within the protein and position its reactive cysteine group close to the flavin. A hydrophobic patch on the surface mediates membrane association, enabling direct substrate and product exchange with the lipid bilayer. Leveraging established knowledge of flavoenzyme inhibition, I designed for the first-time sub-micromolar PCYOX inhibitors. Incidentally, I also discovered that PCYOXs bind and slowly degrade Salisirab, an anti-RAS compound. This activity suggests potential and previously unknown roles of PCYOXs in drug metabolism. ~ Biochemical crosstalk between two or more histone modifications is often observed in epigenetic enzyme regulation, but its functional significance in cells has been difficult to discern. Previous enzymatic studies revealed that Lys14 acetylation of histone H3 can inhibit Lys4 demethylation by lysine-specific demethylase 1 (LSD1). In this thesis, I engineered a mutant form of LSD1, Y391K, which renders the nucleosome demethylase activity of LSD1insensitive to Lys14 acetylation, and I investigated the biochemistry and structural biology of this mutated complex to highlight the structural determinants that allow Y391K to retain its demethylase activity.

Le prenilcisteina ossidasi (PCYOXs) metabolizzano le cisteine prenilate prodotte dalla degradazione delle proteine prenilate. Utilizzano l'ossigeno come co-substrato per produrre cisteina libera, un'aldeide e perossido di idrogeno attraverso l'insolita ossidazione di un legame tioetereo. In questa tesi, ho esplorato l'evoluzione, la struttura e il meccanismo delle due PCYOX mammifere. Un evento di duplicazione genetica negli Gnathostomata ha generato due paraloghi. Entrambi gli enzimi sono attivi sulla farnesil e sulla geranilgeranilcisteina, ma inattivi sulle molecole con gruppi prenilici più corti. Gli esperimenti cinetici delineano un meccanismo in cui la riduzione e la riossidazione della flavina avvengono rapidamente senza intermedi rilevabili, con la velocità di reazione complessiva limitata dal rilascio del prodotto. La struttura tridimensionale determinata sperimentalmente di PCYOX1 rivela un tunnel lungo e largo che conduce dalla superficie alla flavina. Permettono al substrato isoprenoide di posizionarsi all'interno della proteina e posizionare il suo gruppo reattivo cisteinico vicino alla flavina. Una porzione idrofobica sulla superficie media l'associazione alla membrana, consentendo lo scambio diretto di substrato e prodotto con il doppio strato lipidico. Sfruttando la conoscenza consolidata dell'inibizione dei flavoenzimi, ho progettato per la prima volta degli inibitori submicromolari del PCYOX. Infine, ho anche scoperto che PCYOX1 lega e degrada lentamente il Salisirab, un farmaco anti-RAS. Questa attività suggerisce potenziali ruoli e precedentemente sconosciuti di PCYOX1 nel metabolismo dei farmaci. ~ La comunicazione biochimica tra due o più modificazioni istoniche è spesso osservata nella regolazione degli enzimi epigenetici, ma il suo significato funzionale nelle cellule è difficile da decifrare. Precedenti studi enzimatici hanno rivelato che l'acetilazione della Lys14 dell'istone H3 può inibire la demetilazione della Lys4 da parte dalla Lisina-Specifica Demetilasi 1 (LSD1). In questa tesi, ho studiato una forma mutante ingegnerizzata di LSD1, denominata Y391K, che rende l'attività della demetilasica di LSD1 insensibile all'acetilazione sulla Lys14, e ho studiato la biochimica e la biologia strutturale di questo complesso mutato per evidenziarne i determinanti strutturali che consentono a Y391K di ritenere la sua attività catalitica.